4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3 Determinação de Estanho em plasma, coração, rins, pulmões, fígado e ovários
Foram utilizadas ratas da linhagem Wistar como modelo para experimentação. A utilização de ratas pode ser justificada devido à sua prolificidade, fácil manejo, docilidade, pequeno porte, baixo consumo alimentar, fisiologia conhecida e ciclo reprodutivo curto (ANDRADE; PINTO; OLIVEIRA, 2002). A linhagem Wistar é uma das mais utilizadas no mundo (MATTARAIA; MOURA, 2012), principalmente por apresentar alto grau de similaridade genética com seres humanos. Aproximadamente, 80% de seu DNA é idêntico ao DNA humano (GIBBS et al., 2004). Isso permite que se extrapolem resultados científicos obtidos em ratos na estimativa de potenciais efeitos no tratamento em seres humanos.
A exposição dos animais se deu por via oral, por meio de gavagem, que consiste em realizar a administração do medicamento/alimento utilizando um cateter naso/orogástrico, o que garante que o animal recebeu a dose completa.
Na determinação de estanho total em plasma e tecidos de rata pode-se considerar que os resultados obtidos para estanho total podem representar a quantidade de estanho absorvida durante a exposição a TBT, pois há evidências que compostos inorgânicos de estanho praticamente não são absorvidos através da mucosa gastrointestinal (DORNELES et al., 2008). Além disso, trabalhos realizados com a determinação butilestânicos e concentrações totais de estanho em mamíferos marinhos, mostrou que ambos apresentaram o mesmo comportamento em relação à distribuição corporal (DORNELES et al., 2008; TAKAHASHI et al., 2000). Portanto, pode-se considerar que é possível verificar a exposição de mamíferos a compostos organoestânicos por meio da determinação das concentrações de estanho total em seus tecidos.
Outro ponto interessante relacionado a determinação de estanho total é o fato do TBT administrado sofrer metabolização no organismo, podendo ser encontrado nas formas de TBT, DBT, MBT e também em Sn inorgânico (DORNELES et al., 2008)
53 Os animais e as amostras foram divididos em dois grupos onde foram realizadas as análises: Grupo expostos ao TBT (TBT) e o grupo de referência (CON). Ao final do tratamento, as amostras de plasma, coração, rins, pulmões, fígado e ovários dos animais foram coletadas, tratadas e analisadas por Espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado.
4.3.1 Plasma
Inicialmente, realizou-se a determinação de estanho no plasma sanguíneo das ratas. O grupo tratado com TBT apresentou concentração plasmática de estanho média de 56 µg kg-1, enquanto o grupo controle mostrou valores inferiores ao limite de quantificação na amostra (LQ = 2,2 µg kg-1). A comparação entre os resultados de ambos os grupos foi avaliada por meio do teste t (95% de confiança), que mostrou que há diferença significativa entre os grupos. Os resultados da análise de plasma encontram-se apresentados na Tabela 11.
Os valores obtidos estão em concordância com dados apresentados no trabalho de BERTULOSO et al., 2015 em que foram realizadas determinações de estanho em plasma de ratas expostas a TBT por meio de Espectrometria de Absorção Atômica com forno de Grafite, cujo valor médio foi de 41 + 2 µg kg-1.
Tabela 11: Valores de estanho encontrados no plasma dos animais estudados
Amostra Concentração (µg kg-1) Média (µg kg-1) Desvio (µg kg-1) CON < 2,2 < 2,2 < 2,2 < 2,2 < 2,2 - - TBT 15 31,8 47,5 60,1 87,9 53,8 56,2 20,6
4.3.2 Coração
A determinação de estanho em amostras de coração mostrou que o grupo exposto a TBT por 15 dias teve concentração média de estanho de 578,9 µg kg-1 enquanto o grupo controle teve média de 315,1 µg kg-1 (Tabela 12).
54 Tabela 12: Valores de estanho encontrados no coração dos animais estudados
Amostra Concentração (µg kg-1 ) Média (µg kg-1 ) Desvio (µg kg-1 ) CON 306,9 177,6 431,2 450,5 209,5 315,1 124,4 TBT 15 522,2 743,0 529,6 606,1 493,5 578,9 100,8
A presença de uma elevada concentração de estanho no coração de ratas, tratadas com TBT, pode constituir um fator de risco para doenças cardiovasculares (RODRIGUES et al., 2014; SANTOS, R. L. et al., 2012). Estudos demonstram que o tributilestanho prejudica a resposta da reatividade vascular coronariana ao estradiol, produzindo desnudação endotelial e aumento da deposição de colágeno e número de macrófagos (SANTOS, R. L. et al., 2012). A Figura 12 mostra fotos de coração com uma arteríola normal em um animal controle (A), uma arteríola do coração de um animal tratado com TBT com parede engrossada e células inflamatórias nas suas proximidades (B) e macrófagos (células envolvidas na resposta inflamatória) presentes no coração de animais tratados com TBT (C).
55 Figura 12: Micrografia de arteríolas em coração de ratas CON e TBT. (A) Arteríolas normais em coração de animal controle; (B) arteríola hipertrofiada e com células inflamatórias em coração de animal tratato com TBT por 15 dias; (C) mastócitos em arteríolas em animais tratados com TBT. Adaptado de (SANTOS, R. L. et al., 2012)
4.3.3 Rim
Foi realizada também a análise de rins de animais controle e expostos a TBT. Obteve-se uma média de 7 388 µg kg-1 entre os animais tratados com o OT contra 275,2 µg kg-1 entre os animais controle (Tabela 13). Os altos valores encontrados nos rins podem ser explicados por este ser um órgão envolvido com a excreção de xenobióticos, além de apresentar um tecido rico em glutationa e metalotioneína, que apresentam grupamentos SH e, por isso têm afinidade por substâncias como o TBT (KANNAN; FALANDYSZ, 1997).
56 Tabela 13: Valores de estanho encontrados nos rins dos animais estudados
Amostra Concentração (µg kg-1 ) Média (µg kg-1 ) Desvio (µg kg-1 ) CON 250,3 236,7 224,0 362,1 303,0 275,2 57,1 TBT 15 6559 6968 6587 8339 8489 7388 951,6
A Figura 13 mostra colorações Ácido Periódico-Schiff e Tricrômio de Masson (TM) de rins de ratas controle (A e C) e rins de ratas expostas TBT por 15 dias (B e D). A exposição ao TBT prejudicou a morfofisiologia renal, possivelmente devido à redução dos níveis de estrogênio (GRACELI; CICILINI; et al., 2013) e do aumento no estresse oxidativo.
Figura 13: Coloração de Ácido Periódico-Schiff, corando resíduos de açucares, nos grupos CON (A) e TBT (B). Coloração Tricômio de Masson, corando colágeno, nos grupos COM (C) e TBT (D). Retirado de (COUTINHO et al., 2015)
57
4.3.4 Pulmão
A concentração média observada em animais tratados com TBT foi de 430,3 µg kg-1, enquanto o grupo controle teve média de 211,9 µg kg-1, conforme apresentado na Tabela 14. Os dois grupos apresentam diferença significativa, de acordo com o teste t de student (95% confiança).
Tabela 14: Valores de estanho encontrados nos pulmões dos animais estudados
Amostra Concentração (µg kg-1) Média (µg kg-1) Desvio (µg kg-1) CON 247,2 202,6 202,8 192,2 214,9 211,9 21,3 TBT 15 365,5 427,9 394,2 427,4 536,6 430,3 64,8
Estudo realizado em ratos da linhagem Wistar com exposição a 1 e 5 mg kg-1 de tributilestanho mostrou que após 30 dias de exposição os animais apresentaram no dano no tecido pulmonar por meio de ruptura do revestimento da mucosa epitelial dos brônquios (MITRA et al., 2014). Este estudo sugere que as alterações ocorridas nos tecidos podem estar envolvidas com o desequilíbrio redox, devido a um aumento no estresse oxidativo que ocorre na presença do TBT (MITRA et al., 2014).
4.3.5 Fígado
Na determinação de estanho total no fígado obteve a concentração média de 5 489 µg kg-1 em animais tratado com TBT por 15 dias contra 213,0 µg kg-1 no fígado dos animais do grupo controle, conforme apresentados na Tabela 15.
Tabela 15: Valores de estanho encontrados no fígado dos animais estudados
Amostra Concentração (µg kg-1) Média (µg kg-1) Desvio (µg kg-1) CON 448,3 127,3 173,3 159,4 156,9 213,0 132,6 TBT 15 4258 5922 5575 5570 6123 5489 727,6
58 Alterações hepáticas foram observadas em trabalhos realizados com a exposição de ratos a TBT por 15 dias. Foi observado um aumento na deposição lipídica nas células hepáticas (BERTULOSO et al., 2015). Estes dados sugerem que o TBT pode estimular um aumento na deposição/ distribuição do tecido adiposo branco de forma específica e alterar a função metabólica hepática, contribuindo para modificação na função metabólica, que poderia contribuir para o desenvolvimento para a obesidade, tornando-se a sua exposição um fator de risco metabólico (BERTULOSO et al., 2015).
A Figura 14 mostra do lado esquerdo (A e B) a deposição de gordura no fígado de um animal controle e do lado direito (C e D) a deposição de gordura anormalmente aumentada no fígado de um animal exposto a TBT (BERTULOSO et al., 2015).
Figura 14: Tecido hepático corado com a coloração de Oil Red (barra . (A) e (B) controle, deposição lipídica normal depósito de lipídio. (C) e (D) Aumento da deposição de gotículas de lipídios. Barras: A e C = 20 µm; B e D = 10 µm. Retirado de (BERTULOSO et al., 2015)
4.3.6 Ovário
O estanho também foi determinado em amostras de ovários. Nesta análise foram obtidos os valores médios de 560,6 µg kg-1 para o grupo exposto ao TBT e de 239,4 µg kg-1 no grupo controle, sendo os grupos significativamente diferentes de acordo com o teste t de student (95% de confiança). Os OTs atuam no sistema reprodutivo por apresentarem alto potencial como desreguladores endócrinos atuando em invertebrados marinhos e em mamíferos, incluindo os seres humanos e roedores
59 (GRACELI; SENA; et al., 2013). A exposição ao TBT pode causar alterações no sistema reprodutivo de mamíferos, como a diminuição da modulação do eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal (ovários e testículos) (GRACELI; SENA; et al., 2013).
Tabela 16: Valores de estanho encontrados no ovário dos animais estudados
Amostra Concentração (µg kg-1 ) Média (µg kg-1 ) Desvio (µg kg-1 ) CON 280,4 198,5 < 2,2 < 2,2 < 2,2 239,4 57,9 TBT 15 386,1 862,3 433,4 - - 560,6 262,3
A exposição dos ovários ao TBT pode causar prejuízos à função reprodutiva das fêmeas expostas, uma vez que este órgão é responsável pela produção dos hormônios sexuais de acordo com o ciclo reprodutivo e pela ovulação. Trabalhos realizados em ratas expostas a TBT mostraram que 15 dias de exposição causaram redução nos níveis de 17β-estradiol (PODRATZ et al., 2012; RODRIGUES et al., 2014), aumento nos níveis de progesterona e alteração na ciclicidade estral (PODRATZ et al., 2012). Além disso, relatos da literatura mostraram que os animais expostos tiveram também uma redução na relação massa do ovário / massa corporal (PODRATZ et al., 2012).
Outra alteração observada em animais expostos a TBT foi que o tecido do ovário exibiu diferenças morfológicas significativas em relação ao grupo controle, conforme representado na Figura 15. As ratas do grupo controle apresentam folículos antrais, corpo lúteo, e estrutura do folículo com aspecto normal, enquanto as ratas tratadas com TBT demonstraram ovário atrésico, ou seja, com presença de folículos císticos (PODRATZ et al., 2012).
60 Figura 15: Fotomicrografia de secções de ovário de rata CON e TBT (coloração HE, barra 400 mm). (A) fotomicrografia de ovário do grupo controle exibindo alguns folículos antrais (seta) e corpo lúteo (seta). (B) corpo lúteo de ratas CON (estrela). (C) Folículo CON com uma estrutura organizada. (D) ovário atrético de rata do grupo TBT (asteriscos). Presença de folículos císticos (seta) e corpo lúteo (estrela). (E) Animais TBT apresentando corpo lúteo com células em apoptose (seta) na área central. (F) Folículos antrais atréticos com oócito intacto (estrela). (G) Folículos antrais atréticos sem oócito (estrela). Retirado de (PODRATZ et al., 2012).
Os grupos TBT para plasma, coração, rim, pulmão, fígado e ovário apresentaram concentração de estanho significativamente mais elevada que o grupo controle, de acordo com o teste t de student (95% de confiança). Fígado e rim
61 apresentaram a maior concentração de estanho seguidos por coração, pulmão e ovário, com valores semelhantes, e plasma com concentrações de estanho bem inferiores aos demais tecidos. A Figura 16 permite a comparação entre os valores médios de estanho obtido em cada um dos tecidos analisados, bem como as medidas no grupo de referência.
Figura 16: Concentração de estanho em plasma, coração, rim, pulmão, fígado e ovário de ratas expostas a do grupo exposto a 15 dias de TBT e do grupo de
referência 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
Plasma Pulmão Ovário Coração Fígado Rim
C o n ce n tr aç ão µg k g -1 Tecidos analisados
62
5 CONCLUSÃO
O procedimento utilizado para a determinação de Sn em amostras biológicas por ICP- MS, após a digestão ácida assistida por radiação micro-ondas em sistema fechado, pode ser considerado adequado para a determinação de estanho em amostras de tecidos de ratas devido à elevada sensibilidade e boa exatidão alcançadas, permitindo a obtenção de resultados confiáveis.
A presença de estanho no organismo de ratas distribui-se pelos tecidos dos animais expostos, sendo o fígado e rim os tecidos de maior predisposição a bioacumulação, sendo então mais apropriados para avaliação da exposição à TBT.
63
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