Determinação Glutationa e Dissulfureto de Glutationa

O interesse na determinação da GSH e GSSG tem continuadamente crescido, devido ao papel fundamental da GSH no mecanismo de proteção contra o stress oxidativo (Roman Kand’ár, 2016).

A medição GSH, geralmente, é realizada em sangue total, plasma e hemolisado de eritrócitos ou diretamente no tecido (R. Kand’ár & Hájková, 2014).

Até à data, são descritos na literatura científica, vários métodos para a determinação de GSH. Dentro dos vários métodos, destacam-se: os métodos de espectrofotométricos (I. Rahman, Kode, & Biswas, 2006; Araujo, Saraiva, & Lima, 2008), fluorimétrico (Wang et al., 2005; Widengren et al., 2006), electroquímicos (Kizek, Vacek, Trnková, & Jelen, 2004; Rivas et al., 2007; Timur, Odaci, Dincer, Zihnioglu, & Telefoncu, 2008), quimioluminescente (Roman Kand’ár, 2016) e, ressonância magnética nuclear (Terpstra, Marjanska, Henry, Tkáč, & Gruetter, 2006; Mali’n, Lindberg, & Åstot, 2014). Do mesmo modo, métodos de separação, tais como: cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Kandár, Stramová, Drábková, & Brandtnerová, 2014; R. Kand’ár & Hájková, 2014), cromatografia gasosa (GS) (Tea et al., 2007) e electroforese capilar (C. Bayle, Issac, Salvayre, Couderc, & Caussé, 2002; Christophe Bayle, Caussé, & Couderc, 2004; Kowalska, Zalewska, & Milnerowicz, 2014; Xue Wu et al., 2016), tem sido desenvolvidos.

Os métodos cromatográficos utilizando diferentes tipos de detetores, tais como UV-Vis, a fluorescência, eletroforese capilar e, espectrometria de massa MS, de momento, são os mais adequados, segundo Kand’ár (2016).

No entanto, estes métodos frequentemente apresentam falta de sensibilidade e de seletividade e podem exigir um pré-tratamento demorado da amostra, tais como a derivatização com reagentes fluorescentes (Zhang et al., 2008).

A escolha do agente de redução deve ser escolhida com precaução, devido ao facto de muitas vezes reagir com os reagentes de derivatização, e podem, portanto, interferir com o ensaio. Nem a GSH ou GSSG contêm qualquer cromóforo ou fluoróforo forte nas suas moléculas, logo, é necessário uma derivação apropriada por HPLC com deteção de UV, ou de fluorescência e/ou deteção de MS, para aumentar a sua sensibilidade (Roman Kand’ár, 2016).

Os agentes redutores, tais como DTT, 2-mercaptoethanol (2-ME), sodium borohydride,

trialkylphosphinse ditionito de sódio, são empregues para a determinação de TGSH (Roman Kand’ár, 2016).

Para a análise espectrofotométricas os agentes de derivatização empregues são, nomeadamente, N-ethylmaleimide (NEM), ácido iodoacético e reagente de Ellman [5,5′-

dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)], enquanto que, o-ftalaldeído (OPA), derivados de

maleimida são para a análise fluorimétrica (R. Kand’ár & Hájková, 2014; Kandár et al., 2014; Roman Kand’ár, 2016).

A metodologia HPLC com deteção eletroquímica, usando eletrodos quer amperométricos ou coulométricos, tem a vantagem de medir diretamente a GSH e GSSG. Essas técnicas, juntamente com ensaios de espectrometria de HPLC/MS, evitam os problemas típicos associados aos procedimentos de derivação (R. Kand’ár & Hájková, 2014).

O método HPLC-ECD evita a necessidade de derivatização e permite a determinação simultânea de ambos os compostos com tempos de análise relativamente curtos. No entanto, a grande limitação dessa abordagem inclui a perda de sinal de deteção eletroquímica após análise repetida (Squellerio et al., 2012). Além disso, apenas alguns estudos tentaram medir simultaneamente GSH e GSSG, sem adição de qualquer reagente de derivatização (Guček, Makuc, Mlakar, Beričnik-Vrbovšek, & Marsel, 2002; Zhang et al., 2008).

Diferentes tipos de métodos de deteção electroquímica tem sido aplicados para a análise de GSH e compostos relacionados, mas a fluorescência induzida por deteção de laser (LIF) é melhor devido aos baixos limites de deteção de GSH (Christophe Bayle et al., 2004).

Para a determinação da GSH e da GSSG, a metodologia por HPLC com deteção de fluorescência é a preferida. Não apenas por ser um método simples, sensível e robusto, também porque a derivação pode estabilizar tanto GSH e GSSG. A deteção CE é muito sensível e permite a determinação simultânea de GSH e GSSG, além disso, este método evita a oxidação de GSH e a hidrólise de GSSG (Roman Kand’ár, 2016).

Desenvolvimentos recentes na tecnologia espectrometria de massa (MS), acoplada com cromatografia líquida (LC) forneceram novas ferramentas para a quantificação, mais sensível e seletiva, de glutationa (Zhang et al., 2008; Squellerio et al., 2012).

Squellerio e investigadores (2012), no seu artigo, aplicaram a metodologia LC-MS/MS para medir com precisão a GSH no sangue e conteúdo GSSG, sem qualquer etapa de derivação. Para além disso, compararam ao novo método com o doseamento por HPLC- ECD. Ambos os ensaios analíticos são caracterizados com a precisão adequada, e sensibilidade e, as concentrações sanguíneas obtidas pelos dois métodos analíticos estão de acordo. No entanto, descreveram que o método de LC-MS/MS apresenta vantagens significativas para a determinação da GSH e da GSSG, comparativamente ao método HPLC-ECD. Em conclusão, embora ambos os métodos sejam de confiança e de rápida execução, os principais benefícios da metodologia LC-MS/MS estão relacionados com a sua melhor seletividade, precisão e exatidão e a menor variabilidade em comparação com o ensaio de HPLC-ECD, permitindo, assim, a quantificação de ambos os analitos, em amostras de baixa concentração (Squellerio et al., 2012).

A razão GSSG/GSH é considerado um importante indicador de stress oxidativo nas células. Sob condições normais, a concentração da GSSG é muito menor do que a da GSH, o que requer a determinação altamente exata e precisa da GSSG na presença de tais concentrações elevadas de GSH (Roman Kand’ár, 2016). Adicionalmente, o esgotamento de GSH é muitas vezes tomado como um marcador de stress oxidativo (Li et al., 2013). Outro método alternativo para determinar os níveis de GSH é através de sondas fluorescentes para glutationa. Sob certas circunstâncias, tais como no início da apoptose, a glutationa pode efluir a partir das células, o que reduz a capacidade de redução das células e, por conseguinte, pode resultar em stress oxidativo, sem interferência na produção de ROS (Li et al., 2013).

As sondas Monochlorobimances e Monobromobimane são permeáveis na membrana, podem ligar-se aos grupos sulfidrilo e gerar fluorescência, o que pode ser medido em torno de 461-490 nm, quando a amostra é excitada entre 380-395 nm (Li et al., 2013). Segundo (Li et al., 2013), Ortho-ftaldialdeído é outra sonda fluorescente que avalia os níveis totais de glutationa. O aducto tiol é fluorometricamente medido a 455 nm quando a amostra é excitada a 334 nm. O 5,5-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) é a sonda fluorescente que determina o nível de glutationa, ao qual é medida a 420 nm quando a amostra é excitada a 350 nm (Li et al., 2013).

Uma vez que todas as sondas para a determinação do glutationa reagem aos resíduos sulfidrilo das proteínas, é recomendado determinar o nível de GSH em condições sem a presença de proteínas (Li et al., 2013).