5.4.1 Determinação do método de preparo da amostra para análise de HPA’s via CG-EM
Efetuou-se a seleção do método após a reprodução de três métodos de extração, Quechers por RAMALHOSA et al., (2009), extração sólido-líquido utilizando hexano por GARCIA LONDOÑO; REYNOSO; RESNIK, (2015) e extração sólido-líquido utilizando diclorometano e hexano segundo método descrito por DE LIMA et al., (2017). Os resultados das análises cromatográficas das referidas extrações comparadas com a mistura de padrões de concentração 5 ppm são ilustrados na Figura 41:
Figura 41 - Comparação entre os métodos de extração de HPA's segundo os métodos de RAMALHOSA et al., (2009), LONDOÑO, REYNOSO e RESNIL., (2015) e DE LIMA et al., (2017) em comparação ao padrão de misturas (Mix) de concentração 5 ppm.
Os cromatogramas obtidos à partir da reprodução das metodologias citadas (Figura 41) indicam que (para este trabalho e condições de reprodução) os sinais mais intensos foram obtidos para o método proposto por RAMALHOSA et al., (2009), utilizando o preparo de amostras denominado QuEChERS, que utiliza
quantidade reduzida de reagentes e produz poucos resíduos. A Figura 42 ilustra a amostra no processo de partição e limpeza pelo método QuEChERS:
Figura 42 - Processo de partição (coloração verde) e limpeza (coloração amarela) no procedimento QuEChERS
O processo de extração foi realizado em matrizes de amostras tratadas (branqueadas), não tratadas e comercial, e em seguida os extratos foram inseridos em vials identificados e levados para posterior avaliação via CG/EM.
5.4.2 Validação de método de identificação de HPAs via CG/EM
Após verificar a melhor resposta para a extração de HPAs, estimou-se a eficiência no desenvolvimento do método através de parâmetros de validação (Tabela 33):
Analito Faixa de Trabalho (μg.mL-1) Eq. de Reta R2 LD (μg.L-1) LQ (μg.L-1) Benzoantraceno 0,1 - 2,0 y=85298x-5744,7 0,9994 0,020 0,28 Criseno 0,1 - 2,0 y=98177x+429,04 0,9972 0,031 0,22 Benzo(b)fluoranteno 0,1 - 2,0 y=75912x-9005 0,9972 0,024 0,13 Benzopireno 0,1 - 2,0 y=72949x-8997,8 0,9975 0,027 0,22
Tabela 33 - Informações referentes a avaliação do método
5.4.2.1 Sensibilidade, LD e LQ
Para o método cromatográfico, verificou-se maior sensibilidade para o analito Criseno, seguido do Benzoantraceno, Benzo(b)fluoranteno e Benzopireno respectivamente. Essa determinação pode ser feita pelo intermédio da inclinação do gráfico de calibração, onde o maior coeficiente angular terá uma melhor resposta, pois indica que uma pequena variação de concentração (eixo x) resulta em uma variação significativa na resposta (eixo y). Os valores dos coeficientes de determinação evidenciam um ajuste ideal para a linha de regressão dentro dos valores vigentes da ANVISA e INMETRO. Os valores de LQ para os quatro HPAs de interesse ficaram abaixo do valor máximo definido pela legislação europeia (0,58 ug/kg), considerando o ensaio como adequado para a determinação dos compostos.
5.4.2.2 Recuperação e Precisão
Também foram avaliados parâmetros como recuperação e a precisão através do coeficiente de variação em três níveis de concentração (Tabela 34):
Analito
Recuperação (%) Coeficiente de Variação (%)
0,25 (mg.L-1) 0,5 (mg.L-1) 1 (mg.L-1) 0,25 (mg.L-1) 0,5 (mg.L-1) 1 (mg.L-1) Benzoantraceno 72,0 112,0 115,5 9,23 3,16 10,05 Criseno 51,2 82,2 95,4 10,04 4,65 11,93 Benzo(b)fluoranteno 101,5 98,2 112,5 4,90 6,13 11,97 Benzopireno 118,8 119,8 115,6 4,79 8,91 10,64
Com exceção do Criseno, o parâmetro recuperação ficou entre a faixa aceita na maioria dos procedimentos analíticos de validação (70-120%) (LANÇAS, 2004). A baixa recuperação do Criseno pode estar associada à baixa polaridade do composto, o que pode levar a uma afinidade limitada com o solvente, não sendo suficiente para uma extração quantitativa. ROLLE et al., (2017) em sua avaliação de HPAs em chá-verde e mate, avaliaram o ensaio de recuperação em mate em níveis de concentrações inferiores ao deste trabalho (0,35 a 0,50 μg.kg-1). Os valores observados pelos autores foram próximos aos obtidos neste estudo, comparados com o nível de 0,25 mg.L-1 (Tabela 34), sendo 89% para o antraceno, 105% para o criseno, 77% para o benzo(b)fluoranteno e 87% para o benzopireno.
Para avaliar o comportamento dos analitos de interesse nas condições de análise, foram injetados padrões autênticos, verificando as curvas de calibração para os compostos de interesse (Figura 43):
Figura 43 - Curvas de calibração dos HPAs de 0,1 a 2 ppm (1-Benzoantraceno; 2- Criseno; 3 Benzo(b)fluoranteno; 4-Benzo(k)fluoranteno e 5-Benzopireno)
Empregou-se o método de extração na erva-mate fornecida para o estudo (in
natura e após processo de branqueamento) e uma erva-mate comercial comprada
em supermercado local. A Figura 44 ilustra cromatogramas sobrepostos de análises de amostras que não receberam tratamento juntamente com um padrão de mistura de HPAs de concentração 2 ppm:
Figura 44 - Cromatogramas sobrepostos para comparação da extração das amostras in natura (não tratadas) com o padrão de HPA's (2 ppm)
Fonte: Autoria própria
Na Figura 43 verifica-se a ausência dos HPA’s estudados. Um pequeno sinal próximo ao tempo de retenção do benzoantraceno (Tr próximo a 31 min) foi verificado. Para confirmação da sua identidade, o mesmo foi analisado quanto ao seu espectro de massa juntamente com o referido padrão. O resultado está ilustrado na Figura 45:
Figura 45 - Comparação entre os espectros de massas da amostra e padrão autêntico de benzoantraceno
Fonte: Autoria própria
Observando os fragmentos dos espectros de massas da Figura 44, é possível constatar que ambos não se tratam do mesmo analito. O espectro de massa utilizado no modo de íon monitorado ficou bem restrito aos HPA’s de interesse, possibilitando fácil verificação em casos de sinais no mesmo tempo de retenção.
Amostras branqueadas pelo processo de imersão em água aquecida foram analisadas com o objetivo de verificar se o processo pode influenciar nos valores de HPAs. A Figura 46 ilustra cromatogramas sobrepostos de análises de amostras que receberam tratamento juntamente com um padrão mix de HPAs de concentração 2 ppm::
Figura 46 - Cromatogramas sobrepostos para comparação da extração das amostras branqueadas com o padrão de HPA's
Fonte: Autoria própria
Ao comparar as amostras tratadas (Figura 45) e não tratadas (Figura 43) verifica-se que não houve mudanças nos teores analisados, o tratamento térmico não indicou contaminações por HPA’s.Por fim, empregou-se método de extração em uma amostra comercial proveniente de supermercado local, conforme Figura 47:
Figura 47 - Cromatogramas sobrepostos para comparação da extração das amostras comerciais com o padrão de HPA's
Fonte: Autoria própria
A amostra comercial analisada, não apresentou contaminação por nenhum dos HPA’s analisados nesse estudo, demonstrando perfil muito similar ao das matrizes anteriormente analisadas.
Para os HPAs, o método de extração e a análise via cromatografia gasosa mostraram-se capazes de efetuar uma determinação eficaz para os quatro analito analisados (1-Benzoantraceno; 2-Criseno; 3 Benzo(b)fluoranteno; 4- Benzo(k)fluoranteno e 5-Benzopireno).
6 CONCLUSÕES
A avaliação do processo de inativação de peroxidase através do Delineamento Composto Central Rotacional, utilizando o estudo das variáveis independentes temperatura e tempo de exposição, mostrou-se eficaz no processo de branqueamento, empregando o tempo de 90 segundos e temperatura de 87 ºC, sendo ambos fatores significativos para o processo.
A determinação de atividade antioxidante pelos métodos de sequestro dos radicais livres ABTS e DPPH, redução de ferro e teor de compostos fenólicos totais não demonstraram diferenças significativas em comparação ao material tratado pelo processo tradicional (sapeco), demonstrando que o processo alternativo não prejudicou a qualidade do produto em relação aos compostos bioativos.
O planejamento experimental de mistura Simplex Centroide constatou o efeito do solvente metanol como superior aos solventes água, etanol e suas misturas para extração das antraquinonas (Aloe-emodina, Reína, 9,10-Antraquinona, Emodina, Crisofanol e Parietina). Verifica-se também que o etanol obteve uma boa efetividade nas extrações, podendo ser estudado futuramente sua otimização para extração, devido o seu valor e toxicidade inferior ao metanol.
A metodologia via Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para a determinação de Antraquinonas, apresentou resultados adequados de precisão para todos os analitos avaliados. As curvas de calibração expressaram linearidade com valores de coeficiente de determinação acima de 0,99. Os valores de precisão e recuperação ficaram dentro dos valores desejados, até 20% para precisão e entre 70 e 120% para a recuperação. Devido às características químicas das antraquinonas, o detector de fluorescência foi o mais sensível para a determinação dessa classe de compostos.
Os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos responderam bem ao processo de extração QuEChERS, alcançando níveis satisfatórios na faixa de recuperação (com excessão ao benzopireno com 64%) entre 86 e 93,2% para o valor de concentração de 5 μg.kg-1. Para os níveis de 10 e 20 μg.kg-1 a recuperação de todos
os analitos ficaram entre 78,6 e 111,4%.
Os valores de precisão para o método via Cromatografia Gasosa Acoplada à espectrometria de massas não ultrapassaram 12%, sendo esses valores
satisfatórios para a validação. Os valores de coeficiente de determinação atingiram valores acima de 0,9972, numa faixa de trabalho de 0,1 a 2 μg.mL-1. Baixos níveis
de Limite de Detecção e Quantificação foram alcançados, sendo de 0,020 a 0,031 μg.L-1 para o LD e 0,13 a 0,28 μg.L-1 para o LQ.
Por fim, utilizando os métodos descritos nesse trabalho, foi possível comprovar que a forma alternativa de branqueamento do produto erva-mate não influenciou a concentração da Antraquinona e Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos, possibilitando ervateiras da região atender aos requisitos para a comercialização nacional e internacional do produto dentro dos padrões legais.
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