Determinação dos mecanismos de resistência a quinolonas e da concentração inibitória mínima a fluoroquinolona ciprofloxacina

3.8.1 High-resolution melting analysis (HRMA)

A técnica de HRMA foi realizada para todas as 80 linhagens que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e que estão destacadas com um * na Tabela 4 e também para outras 20 linhagens sensíveis a esse antimicrobiano, que foram escolhidas para serem comparadas às linhagens resistentes. As linhagens sensíveis escolhidas foram a SE 4, SE 5, SE 11, SE 30, SE 43, SE 56, SE 88, SE 100, SE 120, SE 150, SE 185, SE 193, SE 241, SE 247, SE 252, SE 304/04, SE 69/05, SE 110/06, SE 189/07 e SE 257/08. Essa metodologia foi utilizada para a detecção de possíveis mutações na quinolone-resistance-determining-region (QRDR) do gene gyrA.

Cada reação foi realizada em um volume final de 20 µL contendo 10 µL de MeltDoctor™ HRM Master Mix (Applied Biosystems), 1,2 µL de cada primer a 5 µM, 4 µL de DNA genômico a 5 ng/ µL e 3,6 µL de água ultrapura, livre de DNAse e RNAse (Life Technologies).

As condições da PCR foram de 1 ciclo a 95ºC por 10 minutos e 40 ciclos que consistiam de 95ºC por 15 segundos e temperatura de hibridação dos primers (Anexo II) por 1 minuto. Reações sem DNA foram utilizadas como controle negativo.

A etapa da HRMA foi realizada imediatamente após a etapa de amplificação. Para isso, os amplicons foram aquecidos a 95ºC por 10 segundos, e então foram resfriados a 60ºC por 1 minuto. As curvas de melting foram geradas aumentando-se a temperatura em 1,6ºC por segundo, partindo-se de 60ºC até 95ºC. A fluorescência foi detectada a cada 0,1 segundos.

A normalização das curvas de melting foi realizada ajustando-se uma região pré e pós melting dos amplicons.

Heteroduplexes foram gerados para diferenciar perfis que apresentaram pontos de mutação com bases complementares, por exemplo, A-T e T-A, adicionando-se uma amostra de DNA exógeno com sequência conhecida à amostra teste.

As curvas normalizadas foram analisadas com o programa 7500 2.0 (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante. O programa agrupa amplicons que possuem curvas de melting similares.

O equipamento utilizado para a técnica de HRMA foi o 7500 Fast Real-Time PCR System apparatus (Applied Biosystems).

3.8.2 Amplificação e sequenciamento da quinolone-resistance-determining-

region (QRDR) do gene gyrA

A amplificação da quinolone-resistance-determining-region (QRDR) do gene gyrA foi realizada por PCR em algumas linhagens representativas escolhidas de cada grupo gerado por HRMA. Em seguida essas linhagens foram enviadas para sequenciamento dessa região amplificada. Especificamente, foram amplificadas e sequenciadas seis linhagens sensíveis, a SE 4, SE 5, SE 11, SE 241, SE 110/06, e a SE 257/08; uma linhagem resistente do grupo A, a SE 191/07; oito linhagens resistentes do grupo B, a SE 126, SE 231, SE 151, SE 34/04, SE 332/05, SE 98/06, SE 203/08 e a SE 141/09; cinco linhagens resistentes do grupo C, a SE 50, SE 273, SE 67/05, SE 139/07 e a SE 197/10; quatro linhagens resistentes do grupo D, a SE 144, SE 168, SE 199 e a SE 211.

Os reagentes utilizados na PCR para as amplificações estão descritos na Tabela 5, utilizando-se ao invés de MgCl2, o MgSO4 (Invitrogen) e Taq DNA

Polimerase High Fidelity (Life Technologies). Os primers utilizados foram o GyrA1 e o StgyrA2 (IDT-DNA) (Anexo II). Amostras do mix completo, sem o DNA foram usadas como controle negativo.

As condições das reações de amplificação foram de desnaturação inicial do DNA genômico por aquecimento a 94ºC por 5 minutos, seguido de 30 ciclos constituídos de separação das fitas de DNA a 94ºC por 45 segundos, hibridação dos primers com temperatura específica (Anexo II) por 45 segundos e extensão a 72ºC por 1 minuto. Após os 30 ciclos, foi realizada a etapa de extensão final de 72ºC por 15 minutos.

O termociclador utilizado foi o DNAEngine® _{Peltier Thermal Cycler (Bio-}

Rad). O produto amplificado foi visualizado por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, preparado em tampão TAE 1X. Cada corrida eletroforética continha um marcador de peso molecular (1Kb Plus DNA Ladder – Life Technologies). Após a eletroforese, os géis foram corados em solução de brometo de etídeo (0,5 µg/mL por 30 minutos), visualizados em transluminador de luz U.V. (Gel Doc XR, Bio- Rad) e registrados com o software fotográfico (Quantity One 4.6.1, Bio-Rad).

O sequenciamento foi realizado no Hemocentro de Ribeirão Preto no sequenciador MegaBACE (GE Healthcare-Amersham Biosciences), conforme descrito por (SOUZA et al., 2010).

Para isso, 1µl do produto de PCR e 0,8µl de cada primer, foram adicionados a 4µl de solução do kit DYEnamic™ ET Dye Terminator (GE Healthcare), próprio para o sequenciamento no MegaBACE™ e água deionizada esterilizada suficiente para o volume final de 10µl em microplaca de 96 poços. Em seguida, a reação foi submetida à amplificação no termociclador DNAEngine® _{Peltier Thermal Cycler (Bio-}

Rad), onde as condições de corrida foram as seguintes: 95º por 2 segundos, 95ºC por 10 segundos, 51ºC por 15 segundos, 60ºC por 1 minuto, repetindo essas três últimas condições por 35 vezes.

Ao completar as reações, as amostras em microplacas de 96 poços foram preparadas para o sequenciamento, seguindo o protocolo de precipitação sugerido pelo manual do kit de sequenciamento. Finalmente, as amostras foram sequenciadas no MegaBACE™ 1000 (GE Healthcare) e os resultados foram salvos em eletroferogramas na extensão abd. As seqüências obtidas foram analisadas individualmente através do programa ChromasPro (Technelysium Pty Ltd).

Para cada uma das linhagens estudadas foram feitas duas reações de sequenciamento com o primer forward e duas reações com o primer reverse.

3.8.3 Pesquisa de genes plasmidiais de resistência e do gene codificador de bomba de efluxo

Os genes plasmidiais de resistência qnrA, qnrB, qnrC, qnrD e qnrS e o gene cromossomal qepA, codificador de bomba de efluxo, foram pesquisados em todas as 80 linhagens que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico (destacadas com * na Tabela 4) e também em 20 linhagens sensíveis a esse antimicrobiano, que foram escolhidas para serem comparadas às linhagens resistentes e mencionadas no item 3.8.2. As condições da PCR são as mesmas apresentadas no item 3.7 e as sequências dos pares de primers estão apresentadas no Anexo II.

3.8.4 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) a ciprofloxacina

A concentração inibitória mínima a ciprofloxacina foi determinada para 80 linhagens que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico (Tabela 4) e também em 20 linhagens sensíveis a esse antimicrobiano (item 3.8.2), que foram escolhidas para serem comparadas às linhagens resistentes.

Para isso, o procedimento realizado foi o mesmo apresentado no teste de susceptibilidade a antimicrobianos (item 3.5), porém, ao invés de discos de antimicrobianos utilizaram-se fitas de Etest® (bioMérieux) do antibiótico ciprofloxacina.