Determinações analíticas

3.3.1 Teor de gordura

Foi determinado segundo o método de Monjonier, após extração com éter etílico e éter de petróleo (AOAC - método 995.19, 2006).

3.3.2 Extrato seco total (EST)

Foi determinado por secagem em estufa a 105 oC, segundo o método AOAC – 920.116 (2006).

3.3.3 Acidez titulável

Os teores de ácidos graxos livres da gordura anidra do leite e do óleo de girassol alto oleico foram determinados pelo método AOCS – Ca 5a-40 (2009) e expressos em % de ácido oleico.

3.3.4 Índice de peróxidos

Foi determinado segundo o método AOCS – Cd 8b-90 (2009), com titulação com Tiossulfato de Sódio 0,01 M.

3.3.5 Composição em ácidos graxos

A composição em ácidos graxos foi determinada em cromatógrafo em fase gasosa (CGC Agilent 6850 Series GC System) equipado com coluna capilar e detector de ionização de chama (FID). A esterificação dos ácidos graxos foi realizada segundo o método de Hartman e Lago (1973). As análises cromatográficas foram realizadas nas seguintes condições: volume injetado: 1,0 μL; divisão de fluxo (split) de 1:50; gás de arraste: Hélio; fluxo coluna: 1,0 mL.min-1; velocidade linear: 24 cm.s-1 temperatura inicial do forno: 110 °C (5 min), com rampa de aquecimento de 5 oC/min até 215 °C, sendo esta temperatura mantida durante 24 min. A temperatura do injetor foi 250 °C e a do detector 280 °C.

As separações dos ésteres metílicos foram realizadas de acordo com o método AOCS Ce – 1f-96 (2009) em coluna capilar DB-23 (Agilent Technologies, EUA) (50 % cianopropilmetilpolisiloxano) com comprimento de 60 m; φ int: 0,25 mm; espessura do filme: 0,25 µm. Para determinação da composição qualitativa da GAL, do OGAO e das misturas lipídicas foi utilizado um padrão comercial de metil éster de ácido graxo C4-C24 (Sigma- Aldrich, Brasil). A composição quantitativa das matérias-primas e misturas lipídicas foi realizada por normalização de área, sendo expressa como porcentagem em massa (g/100 g de ácidos graxos totais). As frações apresentadas na composição em ácidos graxos foi especificada da seguinte forma: C18:1 t (somatório de todos os isômeros de C18:1 trans); C18:2 t (somatório de todos os isômeros não conjugados contendo ao menos uma dupla do tipo trans); C18:3 t (somatório de todos os isômeros não conjugados contendo ao menos uma dupla do tipo trans).

3.3.6 Índice de iodo e saponificação

Foram calculados em função da composição em ácidos graxos segundo os métodos AOCS Cd – 1c-85 e Cd – 31-94 (2009), respectivamente.

3.3.7 Composição em triacilgliceróis

A composição em triacilgliceróis foi determinada por cromatógrafo em fase gasosa (CGC Agilent 6850 Series GC System) com detector de ionização de chama (FID). A coluna capilar utilizada foi DB-17 HT Agilent Catalog: 122-1811 (50 % fenilmetilpolisiloxano), com comprimento de 30 m; φ int: 0,25 mm; espessura do filme: 0,15 µm. As análises cromatográficas foram realizadas nas seguintes condições: concentração da amostra: 5mg/5 mL tetrahidrofurano; volume injetado: 1,0 μL; divisão de fluxo (split) de 1:100; gás de arraste: Hélio; fluxo coluna: 1,0 mL.min-1_{; velocidade linear: 40 cm.s}-1_; temperatura inicial do forno: 250 ºC, com rampa de aquecimento de 5 o_{C/min até 350 °C. A} temperatura do injetor foi mantida a 360 °C e a temperatura do detector em 375 °C.

A composição em triacilgliceróis (TAGs) do OGAO por espécie foi determinada a partir da composição em ácidos graxos obtida experimentalmente. Os cálculos foram realizados pelo software PR Óleos com base na distribuição regioespecífica sn-1,3 random, sn-2 random (ANTONIOSI FILHO; MENDES; LANÇAS, 1995). A identificação dos grupos de TAGs do OGAO e da GAL foi realizada após integração dos picos dos cromatogramas e expressa como porcentagem em massa (g/100 g de triacilgliceróis totais). A composição em triacilgliceróis das bases lipídicas foi calculada a partir da composição química das matérias- primas, considerando-se que a composição em TAGs das misturas representa uma combinação linear entre a GAL e OGAO.

3.3.8 Conteúdo de gordura sólida

O conteúdo de gordura sólida foi determinado segundo o método AOCS Cd – 16b-93 (2009) por acondicionamento das amostras nas temperaturas de leitura, utilizando-se Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) (Bruker pc120 Minispec, Alemanha) e banhos secos de alta precisão (0-70 °C±0,1°C) (TCON 2000 - Duratech, EUA). A temperagem das amostras foi realizada conforme sequência: fusão completa para destruição do hábito cristalino, 5 min a 60 o_{C e estabilizadas por 1 hora a 0} o_{C. As determinações foram}

realizadas em série nas temperaturas de 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 oC. A partir dos dados obtidos experimentalmente, a compatibilidade entre as gorduras misturadas foi avaliada através do diagrama de compatibilidade (BRAIPSON-DANTHINE; DEROANE, 2006; RIBEIRO et al., 2009b; QUAST et al., 2013).

3.3.9 Ponto de fusão

O ponto de fusão foi determinado através do cálculo da temperatura correspondente ao teor de sólidos igual a 4% obtido na equação polinomial ajustada à curva de sólidos por RMN (KARABULUT; TURAN; ERGIN, 2004).

3.3.10 Comportamento térmico de cristalização e fusão

As curvas de cristalização e fusão foram determinadas por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) (DSC Q2000 - TA Instruments, EUA) com calibração por índio, conforme o método AOCS Cj – 1-94 (2009). Aproximadamente 10 mg de amostra foram pesadas em panelas de alumínio e recravadas hermeticamente. As curvas foram realizadas nas seguintes condições: cristalização: temperatura inicial 80 oC por 30 min, seguido de resfriamento a uma taxa de 2 oC/min até -80 oC; fusão: -80 por 30 minutos, seguido de aquecimento a uma taxa de 5 oC/ min até 80 oC. Para avaliação dos resultados foram considerados os seguintes parâmetros: temperatura de início de cristalização e fusão, temperatura final de cristalização e fusão, temperatura do pico máximo de cristalização e fusão e entalpia de cristalização e fusão (BILIADERIS, 1983).

3.3.11 Isoterma de cristalização

As isotermas foram realizadas a 15 oC. Os seguintes equipamentos foram utilizados: Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) (Bruker pc120

Minispec, Alemanha), banhos secos de alta precisão (0-70 °C ± 0,1 °C) (TCON 2000 - Duratech, EUA) e banho Lauda (E200 Ecoline-star edition). As amostras

foram fundidas e mantidas na temperatura de 70 °C por 60 min para completa destruição do histórico cristalino (RIBEIRO et al., 2009a). Em seguida, as determinações foram efetuadas automaticamente a cada 1 min durante 120 min em compartimento de leitura estabilizado na temperatura de 15 °C. A caracterização da cinética de cristalização foi realizada segundo o

período de indução, teor máximo de sólidos e tempo de estabilização da cristalização. A equação de Avrami não linearizada, empregada para o estudo da cristalização é dada por (CAMPOS, 2005):

SFC (t)

SFC

= 1 − e

−kt

Onde, SFC(t) descreve o conteúdo de gordura sólida (%) como função do tempo (t), SFCmáx é o limite do conteúdo de gordura sólida, k é a constante de Avrami (min-1), a qual considera tanto a nucleação quanto o crescimento do cristal e n é o expoente de Avrami, que indica o mecanismo de crescimento dos cristais (WRIGHT et al., 2000). O meio tempo de cristalização (t1/2)expressa a magnitude dos valores de k e n de acordo com:

𝑡_1/2

= (0,693

𝑘

)

1/n

3.3.12 Firmeza

A firmeza foi determinada utilizando-se Analisador de Textura (TA.XT Plus - Stable Micro Systems, Inglaterra), controlado por microcomputador. O probe utilizado foi um cone acrílico com ponta não truncada e ângulo de 45°. As amostras foram fundidas e colocadas em béqueres de 50 mL. O acondicionamento foi realizado em estufa BOD (Marconi, MA415/S) a 5 °C durante 24 h para cristalizar a gordura e em seguida durante 24 h na temperatura de leitura (15 °C). Os testes foram realizados em quadruplicata, utilizando os seguintes parâmetros: distância = 10 mm; velocidade = 2 mm/s; tempo = 5 s (RODRIGUES; ANTON; GIOIELLI, 2003). A firmeza das misturas foi obtida em função da força máxima exercida pelo equipamento e expressa em g.

3.3.13 Microestrutura

A morfologia cristalina foi avaliada por microscopia de luz polarizada (microscópio Olympus modelo BX 51 - San Jose, EUA) acoplado a uma câmera de vídeo digital (Media Cybernetics, Bethesda, EUA). As amostras foram fundidas e 10 uL foram transferidos para lâminas de vidro pré-aquecidas (80 °C/15 min) que em seguida foram cobertas com uma lamínula. As lâminas foram incubadas a 15 e 30 °C durante 24 h em estufa BOD (Marconi, MA415/S). Foram capturadas três imagens para cada amostra pelo software Pro-Plus versão 7.0 (Media Cybernetics, Bethesda, EUA), utilizando luz polarizada com uma ampliação de 20 vezes. O parâmetro de avaliação para a análise quantitativa foi o número total de cristais presentes em uma imagem, a densidade média, a média dos diâmetros dos cristais, a % cristais aglomerados e a média dos diâmetros dos cristais não aglomerados (GAMBOA; GIOIELLI, 2006).

3.3.14 Polimorfismo

A forma polimórfica foi determinada pelo método AOCS Cj – 2-95 (2009). As misturas foram fundidas e estabilizadas a 15 °C durante 7 e 50 dias em uma estufa BOD (Marconi, MA415/S). As análises foram realizadas a 15 °C em um difratômetro Philips PW 1710 (PANalytical, Almelo, Holanda), utilizando a geometria de Bragg-Brentano (θ:2θ) com fonte de radiação Cu Kα (λ = 1.54056 Å, tensão de 40 KV e corrente de 30 mA). As medidas foram obtidas com intervalos de 0.02° em 2θ e tempo de aquisição de 2 s, com verificações de 15 a 40° (varredura angular 2θ). A forma polimórfica foi identificada a partir das distâncias interplanares características dos cristais (short spacings) (SCHENCK; PESCHAR, 2004).