3.7.1 Determinação da Umidade
A umidade inicial do meio foi determinada colocando-se 1,0 g de amostra, em estufa a 35 oC, determinando-se, gravimetricamente, a água liberada após 24 horas.
3.7.2 Determinação do pH
Para a determinação do pH do meio foi utilizada a amostra (1g/10 mL) proveniente da secagem para determinação da umidade, que foi suspensa em 10 mL de água destilada. O pH foi lido em pHmetro digital (DIGIMED, modelo DM 20), após 10 minutos de repouso, com agitação intermitente, da amostra.
3.7.3 Extração das enzimas do meio
A extração das enzimas do meio fermentado foi feita pela incubação de 1 g de amostra com 15 mL de tampão acetato de sódio 50mM, pH 5,0, na temperatura de 30 0C, velocidade de agitação de 200 rpm, por 30 minutos. A amostra foi centrifugada em Centrífuga HEMOS modelo 5836, a 4000 g por 10 minutos e, em seguida, foi filtrada a vácuo utilizando-se conjunto de filtração Millipore e papel de filtro Wathman No 1.
3.7.4. Determinação das atividades enzimáticas
3.7.4.1 Atividade de xilanases (EC 3.2.1.8)
A atividade de xilanases foi determinada pela quantidade de açúcares redutores liberados a partir de xilana “birchwood” (Sigma), conforme descrito por BAILEY et al. (1992). Os acúcares redutores foram dosados pelo método do ácido 3,5 dinitrossalicílico (DNS) (MILLER, 1959).
A solução de xilana foi preparada a partir de 1 g de xilana (“birchwood” - Sigma) diluída com 80 mL de tampão acetato de sódio 50mM, pH 5,0. Em seguida, a solução foi
fervida, com agitação ocasional, e o volume acertado para 100 mL, com o mesmo tampão.
A solução de xilana 1% foi previamente aquecida, colocando-se 0,9 mL da solução em tubos que foram incubados em banho termostatizado, à 50 oC por 5 minutos. Em
seguida, acrescentou-se 100 µL das amostras contendo a enzima, incubando-se a mistura por 5 minutos. Desta, retirou-se 0,5 mL, que foram adicionados à 1 mL de DNS. Esta reação foi conduzida em banho de água fervente por 5 minutos, sendo paralisada com o esfriamento da solução em banho de gelo. Após diluição com 2 mL de água destilada, a absorbância das amostras foi lida em espectrofotômetro (METROLAB modelo 325 BD)a 540 nm, contra um branco reacional. A curva padrão foi feita a partir de xilose (Merck), nas concentrações entre 0,2 e 1,0 g/L.
Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol de açúcares redutores, expressos como xilose, por minuto, a 50°C. sendo a atividade enzimática expressa em U/g.
3.7.4.2 Atividade de celulases
As atividades de endo β-1,4 glucanase ou carboximetilcelulase (Cx) (EC 3.2.1.4) e exo β-1,4 glucanase ou avicelase (C1) (EC 3.2.1.74) foram determinadas segundo técnica descrita por TANAKA et al. (1981) que consiste em conduzir a hidrólise de uma solução de carboximetilcelulose 0,44% em tampão acetato de sódio 0,05 M pH 5,5 para a atividade da fração Cx e de uma suspensão a 1,1%, no mesmo tampão, de celulose microcristalina (Avicel) para a fração C1. A reação foi iniciada pela adição do extrato enzimático à 1 mL dos substratos e procedendo a reação a 50 0C por 60 minutos. A
paralisação da reação se deu pela imersão dos tubos em banho de gelo.
A quantidade de açúcares redutores foi determinada pelo método do DNS (MILLER, 1959). A curva padrão foi feita a partir de glicose (Merck), nas concentrações de 0,2 a 1,0 g/L. Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol de glicose, por minuto, a 50 0C sendo a atividade
3.7.4.3 Atividade de proteases totais
A atividade das proteases totais foi avaliada utilizando-se azocaseína como padrão, conforme descrito por CHARNEY & TOMARELLI (1947).
Em tubos de centrífuga, foram adicionados 0,5 mL de amostra e 0,5 mL de solução de azocaseína 0,5% (p/v), preparada em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0. A mistura foi incubada por 40 minutos a 37 oC sendo adicionado, após este período, 0,5 mL de solução 10% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA), em banho de gelo, com objetivo de paralisar a reação. Os tubos foram centrifugados a 4000 rpm por 10 minutos. Retirou-se, então, 1 mL do sobrenadante e acrescentou-se 1 mL de hidróxido de potássio 5N. A absorbância das amostras foi lida a 428 nm, contra um branco preparado com a adição da amostra após a adição do TCA. Uma unidade de atividade proteásica (U) foi definida como a quantidade de enzima que produz uma diferença unitária entre o branco reacional e a amostra, por minuto, nas condições do ensaio. A atividade enzimática foi expressa em U/g.
3.7.5 Determinação das proteínas totais
Por se tratar de amostra proveniente de cultivo em estado sólido, foi necessário extrair as proteínas do meio, antes da quantificação das mesmas. Para isso, utilizou-se 0,1 g de amostra, 1 mL de NaOH 1 N e 1 mL de água destilada, que foram misturados e levados a um banho de água fervente por 5 minutos. Após, os tubos foram resfriados e centrifugados por 5 minutos a 4000 rpm, sendo o sobrenadante utilizado para a dosagem das proteínas.
O teor de proteínas, determinado pelo método proposto por LOWRY et al. (1951), foi calculado pela equação de uma curva padrão feita com soluções de albumina bovina em concentrações entre 50 e 200 mg/L.
3.7.6 Determinação do conteúdo de glicosamina
Como forma indireta de quantificação do crescimento celular, foi utilizada a dosagem de glicosamina (AIDOO et al., 1981). Para isto, adicionou-se 5 mL de HCl 6N à
0,5 g de amostra, colocando-se a mistura em banho de água fervente por 2 horas. Em seguida, a amostra foi resfriada e filtrada a vácuo. Do sobrenadante, foram transferidos 1 mL para um balão de 25 mL, adicionando-se 1 gota de solução alcóolica de fenolftaleína 0,5% (p/v), sendo a neutralização efetuada com solução de NaOH 3 N, até que a coloração atingisse tonalidade rosa para depois, então, proceder-se a titulação reversa com KHSO4 1%, até que esta coloração desaparecesse. O volume do balão foi, então,
completado com água destilada.
Após esta etapa inicial de extração, tomou-se 1 mL da solução acima e adicionou- se, à mesma, 1 mL de solução de acetil acetona em Na2CO3 0,5 N, colocando a mistura
em banho de água fervente por 20 minutos. Após resfriamento, foram adicionados 6 mL de etanol e, em seguida, 1 mL de p-DAB (reagente de Erlich).
Os tubos foram incubados a 65 oC por 10 minutos e a absorbância foi lida a
530 nm contra um branco de água no lugar da amostra.
A curva padrão foi construída entre as concentrações de 0,01 a 0,2 g/L de glicosamina em água.