Determinações enzimáticas

O teor de proteína total dos homogeneizados celulares para as determinações das atividades enzimáticas específicas foi determinado pelo método de Kruger (1994).

5.7.1 Enzimas digestivas

5.7.1.1 Protease Inespecífica

Para os ensaios da atividade proteolítica inespecífica foi utilizado o método de hidrólise da caseína, adaptado de Walter (1984). Tampões 0,2 M glicina/HCl com pH 2,0 para o estômago e pH 8,0 para cecos pilóricos e intestino anterior foram usados para as diferentes porções do trato gastrintestinal. A mistura de reação foi composta por tampão adequado (500L), caseína 1% (500L) como substrato e alíquota previamente ajustada do homogeneizado como fonte de enzima. Após 60 minutos de incubação a 25˚C, a reação foi interrompida com 500L de TCA 20% (ácido tricloroacético), mantida em gelo fundente por aproximadamente 30 minutos e o precipitado removido por centrifugação a 12.000 x g por 3 minutos para leitura do sobrenadante em 280nm. Todas os pontos foram ensaiados em duplicata e, comparados a dois brancos, um de enzima (onde a quantidade de enzima foi substituída por água) e outro de substrato (onde o substrato foi substituído por água destilada). A tirosina foi utilizada como padrão e uma unidade de atividade enzimática específica foi definida como a quantidade de enzima necessária para formar 1g de tirosina, por minuto (U), e expressa em miligrama de proteína (U/mg de proteína).

5.7.1.2 Tripsina

A atividade proteolítica de tripsina foi determinada conforme metodologia proposta por Hummel (1959) nos homogeneizados celulares de cecos pilóricos e intestino anterior. Foi utilizado tampão TRIS 0,2M e CaCl2 0,01M com pH ajustado para 8,1 sendo que o substrato (1,04mM) TAME (p-toluenossulfonil L-arginina-etilester) foi diluído em tampão. A reação era incubada a 25°C por um minuto. Uma unidade de tripsina foi estabelecida como a variação de absorbância do substrato em 274nm após sua hidrólise completa e expressa como 1µmol de arginina/minuto/mg de proteína.

5.7.1.3 Quimiotripsina

A atividade proteolítica de quimiotripsina foi determinada conforme Hummel (1959) nos homogeneizados celulares de cecos pilóricos e intestino anterior. Foi utilizada a mistura de reação contendo tampão TRIS 0,2M e CaCl2 0,01M pH 7,8 e 0,001mM de BTEE (benzolil-L-tirosina etilester) como substrato de reação. A reação era incubada a 25°C por um minuto. Uma unidade de quimiotripsina foi estabelecida como a variação de absorbância do substrato em 256nm após sua hidrólise completa e expressa como 1µmol tirosina/minuto/mg de proteína.

5.7.1.4 Lipase

A atividade de lípase não-específica foi determinada segundo metodologia adaptada de Albro et al. (1985) nos homogeneizados celulares de estômago, cecos pilóricos e intestino anterior. A reação foi incubada em meio contendo 0,4mM p-nitrofenil miristato em solução tampão 24mM de bicarbonato de amônio pH 7,8 e 0,5% Triton X-100. Após trinta minutos, a reação era interrompida pela adição de NaOH 25mM. A densidade óptica era registrada a 405 nm e uma unidade de atividade enzimática específica foi definida como a quantidade de enzima necessária para formar 1mol de substrato hidrolisado por minuto (U) por mg de proteína (U/min/mg proteína).

5.7.1.5 Amilase

A atividade amilohidrolítica foi estimada nos homogeneizados celulares de estômago, cecos pilóricos e intestino anterior segundo método proposto por Bernfeld (1955) após modificação. Na mistura de reação contendo 1,0mL de solução de amido 5% em tampão citrato/fosfato 0,2M (pH 7,0) e 0,5mL de solução de NaCl 0,5% como cofator enzimático, era adicionado um volume adequado de homogeneizado celular. A reação era incubada a 25˚C por 30 minutos e interrompida com 1,0mL de solução 5% ZnSO4:Ba(OH)2 0,3N. Posteriormente, a mistura de reação era centrifugada a 12.000 x g por 3 minutos e no sobrenadante determinava-se a concentração de glicose livre em 690nm pelo método colorimétrico de Park e Johnson (1949). A atividade específica foi expressa em moles de açúcares redutores totais/minuto/mg de proteína (U/mg proteína).

5.7.1.6 Fosfatase alcalina (FALC)

A atividade de fosfatase alcalina foi determinada nos homogeneizados celulares de intestino total pelo método modificado de Bretaudiere e Spilman segundo Bergmeyer (1983). A uma alíquota de homogeneizado celular era adicionada 100µL de p-

nitrofenilfosfato (0,12M) em uma mistura contendo 2,7mL de tampão glicina pH 8,5 (0,05M) e MgCl2 (0,01M). Após incubação a 30°C por tempo previamente padronizado, a reação era interrompida pela adição de 400µL de NaOH (2.0N) e os tubos eram centrifugados a 5000 x g por três minutos. O sobrenadante era lido em 405 nm contra um branco de reação e o produto de reação foi quantificado pelo coeficiente de extinção molar do p-nitrofenol (ξ405= 18,200 M- 1 _cm-1_{) previamente determinado. A atividade enzimática foi expressa em nmoles de p-} nitrofenolato/min/mg de proteína (U/mg proteína).

5.7.2 Enzimas do Metabolismo

5.7.2.1 Desidrogenases

A atividade das três desidrogenases foi determinada por uma adaptação do método de Hochachka et al. (1978) que se baseia na oxidação do NADH determinada cineticamente em 340nm. O coeficiente de extinção molar do NADH (6,2/mM/cm) foi determinado previamente e utilizado no cálculo de atividade específica.

Lactato desidrogenase (LDH)

A reação da LDH foi monitorada durante 2 minutos com registros de 15 em 15 segundos a 340nm, em meio de reação contendo 200L de ácido pirúvico (0,05M), 100L de NADH (2mM) e 1,7mL de tampão Tris pH 7,5 (0,05M), ao qual era adicionado o homogeneizado celular. A atividade enzimática de fígado está expressa em nmoles/minuto/mg proteína (mU/mg proteína) e de músculo branco em mol/minuto/mg proteína (U/mg proteína).

Malato desidrogenase (MDH)

A reação da MDH foi monitorada durante 2 minutos com registros de 15 em 15 segundos em 340nm, em um meio de reação contendo tampão imidazol pH 7,0 (0,05M), NADH 0,2mM e oxaloacetato 0,33mM, ao qual era adicionado o homogeneizado celular. A atividade enzimática de fígado está expressa em nmoles/minuto/mg proteína (mU/mg proteína) e de músculo branco em moles/minuto/mg proteína (U/mg proteína).

Glutamato desidrogenase (GDH)

A reação da GDH foi monitorada durante 2 minutos com registros de 15 em 15 segundos a 340nm, em um meio de reação contendo 2mL de um coquetel constituído por tampão imidazol pH 7,0 (0,05M), NADH 0,1mM, ADP 1mM, -cetoglutarato 5mM, e

acetato de amônio 250mM, adicionado de homogeneizado celular. A atividade da enzima está expressa em nmoles/minuto/mg proteína (mU/mg proteína).