Diabetes reduz o colágeno da região na furca em camundongos com doença periodontal experimental

3 Materiais e métodos

4.5 Diabetes reduz o colágeno da região na furca em camundongos com doença periodontal experimental

Na figura 5 podemos observar a presença de colágeno pela coloração azul nos cortes histológicos, pela técnica de tricrômio de Masson (figura 5 A – L). Visualmente podemos verificar que o colágeno está reduzido nos animais com DP, N+DP (figura 5D, E, F) e DM+DP (figura 5J, K, L), sendo mais evidenciado nas regiões ósseas, tanto no osso alveolar interdental como no inter-radicular.

Na quantificação de colágeno na região da furca podemos observar que os grupos N+DP e DM+DP mostraram diminuição significativa da porcentagem de colágeno, em comparação aos seus grupos controles N e DM. Esta diminuição de colágeno foi potencializada no grupo DM+DP, quando comparado ao grupo N+DP (figura 5M).

Figura 5 Colágeno está reduzido na região periodontal em camundongos diabéticos submetidos à doença periodontal. Cortes histológicos dos primeiros molares inferiores de 5 animais, corados com tricrômio de Masson, dos grupos normal - N (A, B, C), normal com doença periodontal – N+DP (D, E, F), diabético - DM (G, H, I) e diabético com doença periodontal – DM+DP (J, K, L). O símbolo seta = osso alveolar interdental; P = polpa dental; D = dentina; LP = ligamento periodontal e OA = osso alveolar inter-radicular. Avaliação da quantidade de colágeno por porcentagem usando software Image J por campo contado (100x) (M). Resultados expressam média ± EPM. Valores significativos estão representados por, **p<0,01 (N+DP vs. N); ***p<0,001 (DM+DP vs. DM) e #_{p<0,05 (DM+DP vs. N+PD).}

5 Discussão

A DP e o DM são doenças inflamatórias crônicas, comumente encontradas na população, e quando estas estão associadas podem aumentar grandemente os prejuízos na região periodontal. Por esta razão, o objetivo do nosso estudo foi avaliar o papel do diabetes sobre o processo inflamatório, reabsorção óssea, produção de MMPs, colágeno e TGF-β1 em camundongos com DP experimental.

A DP experimental induzida em nossos animais segue o princípio de que uma ligadura inserida em torno do primeiro molar ocasiona um acúmulo de alimento no local, favorecendo assim a formação de placa bacteriana, cuja é o principal fator etiológico para o desenvolvimento da DP em humanos (Silva, Lorencini et al. 2008, de Molon, Mascarenhas et al. 2015, Llambes, Arias-Herrera et al. 2015). A presença do biofilme produz respostas imunes e não imunes, e as células residentes da região periodontal acabam sendo estimuladas e induzem a liberação de mediadores inflamatórios que atuam no recrutamento de leucócitos para região inflamada, bem como favorecem a destruição óssea por possível ativação de osteoclastos (Okada and Murakami 1998, Graves 2008, Di Benedetto, Gigante et al. 2013). Estudos experimentais tem demonstrado que a indução de DP causa inflamação na região do periodonto e perda de osso alveolar (Li and Amar 2007, Saadi-Thiers, Huck et al. 2013, Kim, Lee et al. 2014, de Molon, Mascarenhas et al. 2015). A indução de DP por ligadura colocada ao redor do primeiro molar maxilar, causou perda óssea significativa em camundongos C57BL/6 após 45 e 60 dias de indução (de Molon, Mascarenhas et al. 2015). O diabetes também pode influenciar a reabsorção de osso alveolar, devido ao fato que, ratos diabéticos com DP tem perda óssea mais significativa quando comparado com animais não diabéticos com DP (Kim, Lee et al.

2014). Em nosso estudo podemos observar o mesmo perfil, em que a DP promoveu perda de osso alveolar em ambos os grupos, N+DP e DM+DP, causando reabsorção óssea mais significativa no grupo DM+DP, mostrando assim que o diabetes potencializou a perda óssea quando associada a DP. Também podemos observar nos nossos resultados que animais sem a indução da doença periodontal, não apresentaram lesão, mesmo sendo estes do grupo DM.

Outra importante característica da DP é a inflamação. Em processos inflamatórios agudos e crônicos, os neutrófilos iniciam importante papel na defesa contra a invasão bacteriana nos tecido circunjacentes, e no periodonto não é diferente (Hajishengallis, Chavakis et al. 2015). Os neutrófilos representam a maior parte dos leucócitos que são recrutados para a região periodontal em resposta ao biofilme, e sua quantidade no local da inflamação está relacionado com a severidade da doença, devido sua alta atividade citotóxica e antimicrobiana (Hajishengallis, Chavakis et al. 2015). No presente estudo, o recrutamento de neutrófilos foi drasticamente aumentado nos animais com DP, sendo mais significante no grupo DM+DP, quando comparado ao grupo N+DP. Essa persistência dos neutrófilos na região periodontal, mesmo passado 15 dias de indução, pode ser explicada pela presença do biofilme, o qual se faz um estímulo constante. Estes achados estão de acordo com estudos prévios da literatura, os quais tem relatado que animais com DP apresentam maior recrutamento de leucócitos com predominante presença de células polimorfonucleares e mononucleares (Li and Amar 2007). O diabetes favorece um maior recrutamento celular, devido ao fato de que animais diabéticos com DP apresentaram maior número de células inflamatórias recrutadas para a região inflamada, em relação a animais não diabéticos com DP (Silva, Lorencini et

al. 2008). Assim podemos verificar que a resposta inflamatória na DP é intensificada quando desenvolvida em quadro diabético.

Como descrito anteriormente, os processos inflamatórios se iniciam com a migração de leucócitos para a região danificada e este recrutamento ocorre devido a liberação de mediadores inflamatórios, tais como citocinas e quimiocinas, em virtude da sinalização das células periodontais residentes, as quais, além de promover o recrutamento dos leucócitos, apresentam papel direto também no metabolismo ósseo (Ryu, Choi et al. 2007, Silva, Garlet et al. 2007). CXCL2 é uma das principais quimiocinas responsáveis pelo recrutamento de neutrófilos (Miotla, Ridger et al. 2001, Diana and Lehuen 2014). Estudos relataram que depois de estímulo com LPS de E. coli no sulco gengival de ratos, pode-se observar um aumento de CXCL2 juntamente com aumento de neutrófilos na região afetada (Miyauchi, Kitagawa et al. 2004). A quimiocina CXCL2 também causa migração de leucócitos em condições diabéticas, pois o estímulo com CXCL2 causou aumento significativo da migração de leucócitos em camundongos C57BL/6 diabéticos (Pettersson, Christoffersson et al. 2011). Em outros dados, também foram observados que a expressão gênica de CXCL2 e o infiltrado inflamatório estão aumentados em camundongos diabéticos depois da inoculação de P. gingivalis em uma região adjacente ao periósteo do crânio (Naguib, Al-Mashat et al. 2004). Nossos resultados corroboram com os dados da literatura, pois a DP aumentou significativamente a produção de CXCL2, e o diabetes potencializou esta liberação. O mesmo foi observado com a quimiocina CCL3, a qual apresentou aumento significativo no grupo DM+DP. A quimiocina CCL3 também possui atividade quimiotática para neutrófilos (Reichel, Rehberg et al. 2009), tendo forte associação com o status periodontal, pois seus níveis estão aumentados em periodontites, e além disso, tem sido considerada como importante

biomarcador de evolução da doença, bem como de perda óssea (Driscoll 1994, Menten, Wuyts et al. 2002, Garlet, Avila-Campos et al. 2005, Sexton, Lin et al. 2011, Al-Sabbagh, Alladah et al. 2012, Fine, Markowitz et al. 2014, Souto, Queiroz et al. 2014). Esta quimiocina também é apresentada como um mediador patológico comum do DM, devido ao fato que indivíduos diabéticos com DP possuem maior produção de níveis de CCL3, comparados a indivíduos não diabéticos (Duarte, Bezerra et al. 2014). Aumento dos níveis de CXCL2 e CCL3 no grupo DM+DP encontrados em nosso estudo, podem estar relacionados com o aumento do número de neutrófilos recrutados para a região periodontal, já que estas duas quimiocinas tem forte poder quimiotático para neutrófilos, favorecendo assim o processo inflamatório e destrutivo do periodonto.

Para investigar características de reparo tecidual durante o diabetes na presença de DP, foi analisado a participação do TGF-β1. O TGF-β1 inicia um importante papel na ativação da inflamação e na resolução de respostas inflamatórias em uma variedade de doenças autoimunes (Shull, Ormsby et al. 1992). Possui papel pró-inflamatório, por estimular resposta inflamatória com padrão th17 (Han, Li et al. 2012). Além disso, é um importante fator de crescimento envolvido em processo de reparo tecidual, sendo responsável por regular a produção de moléculas de MEC, e reduzir sua degradação (Branton and Kopp 1999, Tuxhorn, Ayala et al. 2002). Em nosso estudo a expressão gênica de TGF-β1 foi menor nos grupos com DP, sendo que, no grupo DM+DP ocorreu uma redução mais significativa. Entretanto, a produção de TGF-β1 analisada por ELISA, mostrou níveis aumentados nos grupos com DP. Uma possível explicação para este fato é que possivelmente ocorreu uma expressão elevada de TGF-_{β1 antes do 15º dia, visto} que a produção da proteína está aumentada neste período. De acordo com dados

da literatura, biópsias de tecido gengival de pacientes com periodontite crônica mostraram quantidade significativamente maior de tipos celulares produtores de TGF-β1, em relação à amostras de tecido gengival saudável, sendo que a maioria destas células era composta por neutrófilos (34-35%), seguida por macrófagos (21- 29%) (Steinsvoll, Halstensen et al. 1999). Em amostras de fluído gengival, saliva, e gengiva, também pode-se observar que os níveis de TGF-_{β1 apresentaram-se mais} elevados em indivíduos com DP, em comparação a indivíduos saudáveis (Skaleric, Kramar et al. 1997, Gurkan, Emingil et al. 2006, Khalaf, Lonn et al. 2014, Vikram, Ramakrishnan et al. 2015). O TGF-β1 em quantidades exageradas pode favorecer a patogênese da DP em conjunto com outros mediadores inflamatórios (Gurkan, Emingil et al. 2006). Vikram et al. (2015), demonstraram claramente em seu estudo que o TGF-β1 pode estar envolvido na patogênese e diagnóstico da DP, pois verificaram que indivíduos com DP continham níveis elevados de TGF-β1, porém estes níveis foram reduzidos após tratamento cirúrgicos. O diabetes também parece ser responsável pela alteração dos níveis de TGF-β1. Níveis séricos de TGF-β foram significantemente maiores em pacientes jovens com DM tipo 1 em comparação a indivíduos não diabéticos, principalmente quando relacionados a tempo de duração do quadro diabético (Jakus, Sapak et al. 2012, Zorena, Raczynska et al. 2013). Em nosso estudo, como mencionado anteriormente, foi verificado um aumento de TGF- β1 em amostras de tecido gengival derivadas de camundongos normais e diabéticos com DP, este aumento pode ser explicado como uma possível tentativa de reparo no tecido periodontal pelas células residentes, como também, derivado do aumento do recrutamento de neutrófilos para o local da lesão, visto que leucócitos polimorfonucleares são capazes de produzir TGF-_{β1 (Steinsvoll, Halstensen et al.} 1999). Como TGF-β1 exerce papel duplo, podendo apresentar tanto aumento da

resposta pró-inflamatória como auxiliar no reparo tecidual, é de extrema importância desenvolver estudos voltados a entender os mecanismos pelo qual atua o TGF-β1, para que assim possamos compreender melhor qual de fato é seu papel na DP, principalmente na presença de uma doença sistêmica como o diabetes.

A produção das MMPs também é um ponto importante a ser verificado, pois estas enzimas têm sido associadas com a progressão da DP, em virtude de possuírem substratos que são essenciais para a integridade da região periodontal (Kim, Chung et al. 2013). A expressão gênica de MMP-2, apesar de verificarmos leve tendência para diminuição da expressão nos grupos com DP, mostrou não haver diferença estatística entre os grupos analisados. Dados prévios da literatura também mostraram que a expressão gênica de MMP-2 em tecido gengival de ratos com DP não apresentaram diferença estatística nos grupos analisados, independentemente do período de indução da DP (Rodini, Batista et al. 2008). Em relação a expressão de MMP-9, nossos dados apresentaram significante diminuição no grupo DM+DP, demonstrando o mesmo perfil da expressão do RNA mensageiro e da produção da proteína do TGF-β1, como mencionado anteriormente. A literatura demonstra que a expressão gênica de MMP-9 diminui 15 dias após a indução de DP em animais diabéticos (Silva, Lorencini et al. 2008), assim como no nosso estudo.

Em relação a atividade enzimática, nossos dados demonstraram uma resposta contrária a expressão do RNA mensageiro como citado anteriormente, visto que a indução da DP experimental em nossos grupos mostrou aumento significativo na atividade de MMP-2 e MMP-9, e uma potencialização da MMP-2 em animais com diabetes. Dados da literatura também mostraram aumento das MMPs em na presença de DP. Autores observaram aumento na atividade enzimática de MMP-2 e MMP-9 durante a progressão de gengivite experimental em ratos Wistar (Lorencini,

Silva et al. 2009). Em amostras de tecido gengival com inflamação severa de pacientes, também foi observado aumento da atividade de MMP-2 e MMP-9, comparados ao grupo controle (Ejeil, Igondjo-Tchen et al. 2003). Autores também relataram que a alta atividade de MMP-2 em vasculatura arterial tem sido associada ao diabetes (Chung, Booth et al. 2008). Recentemente foi constatado que o diabetes causa prejuízos vasculares via MMP-2 endotelial (Chao, Chuang et al. 2016), corroborando assim com nossos resultados.

O aumento das MMPs demonstrado em nosso estudo, pode estar relacionado com o estímulo inflamatório, e das células residentes. Autores demostraram que fragmentos de tecido gengival de ratos com gengivites, apresentaram marcação de MMP-2 e MMP-9 em células do epitélio gengival, células inflamatórias, fibroblastos e em vasos sanguíneos (Lorencini, Silva et al. 2009). Lorencini et al. (2009), também verificaram que a presença de MMP-2 foi mais evidente no tecido entre 3 a 5 dias de inflamação, em que a principal célula marcada foi o fibroblasto presente no tecido conjuntivo. Fibroblastos são capazes de sintetizar e liberar vários tipos de MMPs, e a MMP-2 é uma delas (Achong, Nishimura et al. 2003). Autores também correlacionaram o aumento de MMP-9 com o pico de recrutamento de células inflamatórias para o local da inflamação, principalmente neutrófilos, pois a MMP-9 é constitutivamente expressa por leucócitos polimorfonucleares e macrófagos (Lorencini, Silva et al. 2009). A atividade dos neutrófilos durante a inflamação é capaz de liberar uma grande variedade de substâncias armazenadas em seus grânulos, incluindo MMPs (Westerlund, Ingman et al. 1996). Estes dados estão de acordo com os do nosso estudo, onde se sugere que o aumento da atividade enzimática de MMP-2 e MMP-9 ocorre em virtude da formação do biofilme, em que

favorece a estimulação das células residentes, e recrutamento de células inflamatórias tais como neutrófilos, proporcionando assim a liberação das MMPs.

Este aumento da atividade de MMP-2 e MMP-9 observado em nosso estudo e em dados de literatura pode estar relacionado aos prejuízos teciduais causados pela DP, especialmente quando associados com o diabetes. Esta destruição tecidual pode ocorrer em virtude da degradação de substratos específicos, como o colágeno (Lazar, Loghin et al. 2015). Em nossos resultados pode ser verificado que a DP diminuiu a porcentagem da área de colágeno na região do periodonto, tanto no grupo N+DP como no DM+DP, principalmente observado no osso alveolar, visto que o osso alveolar possui matriz orgânica composta por cerca de 90% de colágeno (Becker, Schuppan et al. 1986), e esta redução da quantidade de colágeno foi potencializada no grupo DM+DP. Em relação a expressão do RNA mensageiro de col1a2, observamos também que ocorreu uma diminuição no tecido gengival. Dados da literatura corroboram com os nossos resultados, os quais analisaram o colágeno em amostras gengivais de pacientes durante a DP, e mostraram que a DP causa destruição MEC, e redução da expressão de colágeno, levando a alterações teciduais significativas (Almeida, Valverde et al. 2015). Outros estudos, mostraram que a indução de DP em ratos reduziu a porcentagem de fibras de colágeno em cortes histológicos, proporcionalmente ao tempo indução da inflamação (Lorencini, Silva et al. 2009). Em amostras de tecido gengival de pacientes com periodontite severa, foi observado a diminuição da área de fibras de colágeno (33%), em comparação a indivíduos saudáveis (60%) (Seguier, Gogly et al. 2001), o mesmo perfil observado por Ejeil et al. (2003), o qual observou diminuição significativa das fibras de colágeno no grupo com inflamação gengival severa (35%), em comparação com o grupo controle (53%). A condição diabética é um outro fator importante que

altera a produção de colágeno (Spanheimer, Umpierrez et al. 1988). Dados prévios da literatura relataram que há diminuição significativa da produção de colágeno em cartilagem articular e tecido ósseo parietal em ratos diabéticos, e esta redução foi correlacionada com a concentração de glicose plasmática (Spanheimer, Umpierrez et al. 1988). Indivíduos diabéticos apresentam alteração significativa no tecido periodontal (Monea, Mezei et al. 2012). Em tecido conjuntivo e epitélio gengival de ratos diabéticos com DP foi observado que o diabetes favorece a degeneração destas estruturas teciduais (Silva, Lorencini et al. 2008). Esta redução do colágeno observado em nosso estudo, pode ter ocorrido em virtude da elevada atividade das MMPs, e este desequilíbrio pode favorecer a destruição das estruturas periodontais, proporcionando possível perda do suporte e sustentação dos dentes.

Em resumo, nossos resultados mostraram uma pronunciada resposta inflamatória no grupo DM+DP, marcada por significativa perda óssea, elevados parâmetros pro-inflamatórios, tais como, migração de neutrófilos, aumento da produção de CXCL2 e CCL3 e aumento da atividade de MMP-2 com diminuição de colágeno. Isto sugere que a evolução do processo inflamatório ocorrido na DP é agravado sob influência do diabetes, podendo comprometer gravemente os tecidos periodontais em virtude da perda óssea e desequilíbrio entre produção de colágeno e atividade das MMPs. Estudos futuros estão sendo conduzidos no sentido de avaliar os mecanismos envolvidos nestes processos para que possamos obter novas ferramentas para o controle da agravante destruição periodontal em pacientes com diabetes.

6 Conclusão

Com os dados obtidos no presente estudo podemos concluir que há influência do diabetes no desenvolvimento do processo inflamatório, reparo tecidual e reabsorção óssea durante a doença periodontal.

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No documento Diabetes promove potencialização da reabsorção óssea alveolar e causa desequilíbrio entre MMPS e colágeno em camundongos com doença periodontal experimental (páginas 56-76)