O Diagnóstico Genético Pré-implantação (DGPI) é uma forma de diagnóstico pré-natal in vitro e no qual, após investigação genética, os embriões não afetados são transferidos para o útero materno (Teles, 2011). O DGPI foi desenvolvido no fim da década de 90 com o objetivo de ajudar casais em risco de transmitir uma doença para a descendência (Elder e Dale, 2003). Um outro tipo de diagnóstico pré-natal é a amniocentese, mas este tem a desvantagem de, obtendo-se o resultado de que o feto está afetado, o casal ter de decidir se termina a gravidez. Por sua vez, o DGPI tem a vantagem de ser realizado pré-implantação e assim só os embriões não afetados são transferidos (Elder e Dale, 2003).
Em Portugal, o DGPI é destinado “a pessoas provenientes de famílias com
alterações que causam a morte precoce ou doença grave, quando existe risco elevado de transmissão à sua descendência” (artigo 29º da lei nº 32/2006). O DGPI
está também indicado em casos de idade materna avançada (>35 anos), falhas repetidas de implantação, abortos de repetição e em casos de infertilidade masculina severa (Hens et al., 2013).
O DGPI está incluído em ciclos de fertilização in vitro que se inicia como qualquer outro: estimulação ovárica seguida de punção folicular, fertilização in vitro e cultura embrionária. A técnica de fertilização recomendada é a ICSI por evitar a contaminação com DNA de espermatozoides e de células da granulosa. O DGPI engloba a biópsia embrionária, que deve ser feita por um embriologista experiente, e o diagnóstico genético que deve ser realizado por um geneticista (Elder e Dale, 2003). O diagnóstico pode ser realizado em três fases de desenvolvimento:
• Ovócito/zigoto – biópsia de glóbulos polares
• Embriões em fase de clivagem – biópsia de um a dois blastómeros • Embriões em fase de blastocisto – biópsia de células da
trofoectoderme (Elder e Dale, 2003; Teles, 2011).
Para realizar a biópsia, é necessário criar uma abertura na zona pelúcida que pode ser conseguida por métodos mecânicos, químicos ou por laser, tal como na eclosão assistida (Teles, 2011) e é realizada utilizando o equipamento de micromanipulação (Elder e Dale, 2003).
A biópsia dos glóbulos polares pode ser realizada em ovócitos (1º GP) (figura 42) ou em zigotos (1º e/ou 2º GP). Este tipo de biópsia ultrapassa objeções éticas à biópsia embrionária pois pode ser realizada pré-conceção (ovócito) e não retira nenhuma célula ao embrião. No entanto, só permite obter informações sobre o genoma materno (Teles, 2011). A biópsia dos GP tem sido utilizada para diagnósticos de aneuploidias em casos de idade avançada e em que a paciente seja portadora de anomalias cromossómicas (Elder e Dale, 2003).
A biópsia mais utilizada é a de um ou dois blastómeros de embriões em fase de clivagem (figura 43) (Teles, 2011). O embrião é fixado com recurso a uma pipeta
holding e, após abertura da zona pelúcida, uma pipeta aspira um blastómero com
recurso a uma pequena sucção. Esta técnica deve ser realizada quando o embrião apresenta 6 a 10 células e pouco antes da compactação pois após esta ocorrer é difícil retirar apenas um blastómero (Elder e Dale, 2003). Um dos problemas com que se depara esta técnica é o mosaicismo que pode ocorrer, ou seja, a presença de blastómeros normais e anormais (euploides e aneuploides) no mesmo embrião. Por este motivo, podem ser retirados dois blastómeros, para evitar falsos positivos.
A biópsia de células da trofoectoderme de blastocistos é outra possibilidade no DGPI. Nesta técnica, o blastocisto é fixado e é feita uma incisão na zona pelúcida, do lado oposto à massa celular interna. O embrião é deixado em repouso durante 6 a 24h até que a trofoectoderme comece a emergir da excisão feita. Neste momento, é excisada uma parte de trofoectoderme (Elder e Dale, 2003). Este tipo de biópsia tem a vantagem de não perturbar a massa celular interna e não comprometer a viabilidade do embrião. No entanto, muitos embriões não conseguem chegar à fase de blastocisto in vitro, mas poderiam tê-lo conseguido já no útero (Hens et al., 2013). Outra desvantagem são os elevados valores de mosaicismo cromossomal e o facto de células anormais serem encaminhadas para a trofoectoderme durante o desenvolvimento (Elder e Dale, 2003). Para além disso, a biópsia da trofoectoderme de blastocistos implica sempre a criopreservação dos embriões (Teles, 2011) uma vez que é necessário esperar pelos resultados da análise genética. Este deixou de ser um entrave a esta técnica após a introdução da vitrificação, que permite manter os embriões enquanto se aguarda pelos resultados na análise genética e se discute os mesmos com o casal, sem comprometer a viabilidade embrionária (Hens et al., 2013).
Após a biópsia, as células recolhidas são submetidas a análise genética. Esta pode ser feita por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou pela hibridização in situ de sondas fluorescentes (FISH). A técnica de PCR é usada em casos de defeitos num único gene, repetição de tripletos e determinação do sexo do embrião. As duas principais desvantagens são a possibilidade de contaminação e o alelle dropout, ou seja, a amplificação preferencial de um alelo em detrimento do outro (Elder e Dale, 2003; Teles, 2011). A técnica de FISH é usada para deteção de anomalias cromossómicas. Nesta técnica, todos os núcleos podem ser analisados mas o número de cromossomas visualizados em simultâneo é limitado. Pode ser usadas sondas para os cromossomas X e Y para determinação do sexo do embrião em doenças ligadas ao cromossoma X, sondas para os cromossomas envolvidos em anomalias estruturais e sondas para os cromossomas 13, 18, 21, X, Y, 16 e 22 para a deteção de aneuploidias (Elder e Dale, 2003).
Mais recentemente, foram surgindo técnicas baseadas em arrays de polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) e hibridação genómica comparativa (Harper e Harton, 2010).
Após a análise genética, são transferidos os embriões que não sejam afetados por doenças e que se mantenham viáveis em cultura, no caso de embriões biopsados em fase de clivagem, ou após desvitrificação, em caso de embriões biopsados em fase de blastocisto.
Fig. 42 – Processo de biópsia do 1º glóbulo polar em ovócito, com abertura da zona pelúcida (a) e aspiração do 1ºGP (b). Adaptado de Veeck (1999).
a) b)
Fig. 43 – Processo de biópsia de um blastómero em embrião em fase de clivagem, com introduçãoo da pipeta de aspiraçãoo no local de abertura da zona pelúcida (a) e aspiração do blastómero enquanto a pipeta é retirada do embrião (b). Adaptado de Veeck (1999).