Diagnóstico molecular

5.5.1 Extração de DNA

As concentrações de ácido nucléico provenientes das papas de leucócito apresentaram uma média de 40,17 ng/uL. A média da relação 260/280 foi de 1,6. Além disso, o DNA de algumas amostras analisadas apresentou uma boa integridade, conforme demostrado pela corrida em gel de agarose dos produtos extraídos.

5.5.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

 Padronização

O ensaio da PCR variando o volume de DNA da amostra na reação, mostrou melhores resultados (aumento da sensibilidade) quando utilizou-se 3 μL de DNA.

Já o teste do gradiente de temperatura de anelamento dos primers, evidenciou que a melhor temperatura a ser usada foi a de 59 °C, pela formação de banda única e mais nítida (Figura 53).

A avaliação do emprego de diferentes aditivos (DMSO, BSA e TMAC) na PCR mostrou que o TMAC foi o que determinou melhores resultados na minimização/ eliminação das bandas espúrias, facilitando em muito a interpretação do resultado. A partir de então, passou a ser utilizado em todas as reações. A figura 54 evidencia os efeitos do TMAC no processo de otimização da PCR.

Figura 53 - Gradiente de temperatura de anelamento dos primers. Gel de agarose 1,5% . Seta branca indica a temperatura escolhida (59 °C). – São Paulo – 2011

Figura 54 - Comparação entra as condições iniciais da PCR (A) e após a otimização com TMAC (B), utilizando DNA proveniente de papa de leucócitos dos mesmos primatas. Gel de agarose 1,5% - São Paulo – 2011

54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 Ladder 50 bp Ladder 50 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 Ladder 50 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 (A) (B)

Sendo assim, as condições finais da PCR para o diagnóstico de Leishmania spp. após a otimização foram: 10,0 μL de GoTaq® Green Master Mix 2X (Promega®), 1,0 μL de cada primer (10 mM), 3,0 μL de água DNAase free, 2 uL de TMAC (500mM) e 3 μL do DNA. E as condições de ciclagem estabelecidas foram: desnaturação inicial a 940C por 4 minutos, seguida de 40 ciclos a 940C por 30 segundos, 590C por 30 segundos, 720C por 30 segundos.

Além disso, a avaliação da sensibilidade analítica da PCR resultou na detecção de 0,01 parasitas ou 3,5 fentogramas de DNA/ uL, utilizando DNA proveniente de culturas de L. (L.) chagasi (Figura 55).

Todas as amostras negativas na PCR-RFLP foram positivas na PCR utilizando como alvo o gene de β-actina (Figura 56).

Figura 55 - Diluições seriadas do DNA provenientes de cultura de L. (L.) chagasi para determinar sensibilidade analítica do teste: 0,01 parasitas ou 3,5 fentogramas de DNA/ μL – São Paulo- 2011

105 104 103 102 101 10-1 10-2

Figura 56 - Exemplo de amostras que foram positivas na PCR tendo como alvo o gene de β-

actina – São Paulo – 2011

 Teste das amostras

Foram testadas papas de leucócitos de 114 animais de vida livre e 71 de cativeiro. Ao todo, 26,4% (49/185) dos animais foram positivos para Leishmania spp., sendo que 79,5% (39/49) pertencentes à família Cebidae e 18,3% (9/49) à Atelidae, enquanto 47% (23/49) eram machos e 53% (26/49) fêmeas.

Entretanto, do total de animais analisados neste ensaio, 8,6% (16/185) apresentaram linfoadenomegalia: 7% (13/185) eram in situ e 1,6% (3/185) ex situ. Ao todo, 68,7% (11/16) dos primatas com acometimento do linfonodo foram positivos para Leishmania spp. e destes, 63,6% (7/11) pertenciam à família Cebidae, 9% (1/11) à Atelidae e 27,2% (3/11) à Pithecidae. Além disso, 63,6% (7/11) eram fêmeas e 36,3% (4/11) eram machos.

Dos animais de cativeiro, 29,6% (21/71) foram positivos para Leishmania spp., na papa de leucócitos, sendo 62% (13/21) fêmeas e 38% (8/21) machos. Ainda, 9,8% (7/21) eram do DEPAVE-CRAS, 4,2% (3/21) do DEPAVE- Ibirapuera, 5,6% (4/21) do CETAS de Lorena, 4,2% (3/21) do CETAS UNIMONTE e 5,6% (4/21) do Zoológico de Bauru. Todos os animais que tiveram linfoadenomegalia foram positivos na PCR para Leishmania spp. (3/3).

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CN PM

1-10= Amostras clínicas CN= controle negativo

Dos animais de vida livre, 24,6% (28/114) foram positivos na PCR da papa de leucócitos, para Leishmania spp., sendo 46% (13/28) fêmeas e 54% (15/28) machos. Dos animais in situ positivos na PCR da papa de leucócitos, 92,3% (26/28) eram de São Joaquim da Barra (PCH), 3,6% (1/28) de Patrocínio Paulista e 3,6% (1/28) do Amazonas, BR-319. Entretanto, do total de linfonodos avaliados para os animais in situ, 61,5% (8/13) foram positivos para Leishmania spp (Tabela 5).

No ensaio em tela, computando todos os animais do estado de São Paulo, 29% (48/166) foram positivos na papa de leucócitos, sendo que destes 56,2% (27/48) eram in situ e 43,7% (21/48) ex situ. Na análise pela PCR dos linfonodos dos animais de São Paulo, 31,2% (5/16) foram positivos, sendo todos fêmeas (Tabela 5).

Para os animais da região amazônica, 5,2% (1/19) dos animais avaliados foram positivos na PCR da papa de leucócitos, sendo este o P176, C. macrocephalus do Amazonas, capturado na BR-319. Além disso, 31,5% (6/19) dos animais da região amazônica foram positivos na PCR de linfonodo para Leishmania spp. (Tabela 5).

Dos 68,7% (11/16) de animais positivos no linfonodo, 12,5% (2/16) também foram positivos na PCR da papa de leucócito.

Tabela 5 - Distribuição dos resultados positivos na PCR para os animais in situ e ex situ, em relação a São Paulo e Amazônia: (A) amostras de papa de leucócito e (B) amostras de punção aspirativa de linfonodo – São Paulo - 2008 - 2012

(A) (B)

SP Amazônia Total SP Amazônia Total

In situ _(27/95) 28,4% _(1/19) 5,2% _(28/114) 24,5% In situ 33,3% _(2/6) 85,7% _(6/7) 61,5% _(8/13)

Ex situ _(21/71) 29,5% 0 _(21/71) 29,5% _{Ex situ} 100% _(3/3) 0 100% _(3/3)

5.5.3 Digestão do produto de PCR – RFLP

 Padronização

Os fragmentos gerados após a restrição com Hae III dos produtos da PCR das amostras provenientes das cepas de Leishmania foram escolhidos como padrões para comparação com as amostras clínicas. A digestão da L. (L) chagasi gerou dois fragmentos, um em torno de 120 pb e outro em 60 pb. A L. (L.) amazonensis e a L. (V.) lainsoni não foram digeridas com o emprego da enzima e todos as outras cepas do subgênero Viannia, geraram três fragmentos, em torno de 120, 80 e 40 pb (Figura 57).

Figura 57 - PCR-RFLP de DNA proveniente de cultura, cepas padrões: 1. L. (L.) chagasi, 2. L.

(L.) amazonensis, 3. L. (V.) braziliensis, 4. L. (V.) shawi, 5. L. (V.) guyanensis, 6. L. (V.) naiffi, 7. L. (V.) lindenberg, 8. L. (V.) lainsoni. Observar que a digestão da L. (L.) chagasi gera 2 fragmentos, sendo um em torno de 120 e outro 60 pb. A .L. (L.) amazonensis e a L. (V.) lainsoni não sofrem digestão e todos as outras cepas do

grupo Viannia, geram 3 fragmentos em torno de 120, 80 e 40 pb- São Paulo- 2011

A B

25 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 50 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 CN

 Teste das amostras

Após o uso da enzima de restrição HaeIII, e comparação com os padrões, encontramos que do total de animais avaliados, 3,8% (7/185) foram positivos para Leishmania do subgênero Viannia, 11,4% (21/185) para L. (L.) chagasi, 1,0% (2/185) para Leishmania spp. podendo ser L. amazonensis ou L. lainsoni por não ter havido restrição e 10,2% (19/185) continuaram como Leishmania spp. por terem gerado fragmentos, porém não compatíveis aos encontrados nas cepas-padrão.

Dos 29,6% (21/71) de animais de cativeiro positivos na PCR, o parasita em 7,0% (5/71) dos casos foi classificado após a digestão como Leishmania do subgênero Viannia, 4,2% (3/71) como L. (L.) chagasi e 16,9% (12/71) permaneceu como Leishmania spp.

Dos 24,6% (28/114) animais de vida livre, 0,8% (1/114) foram positivos para Leishmania do subgênero Viannia, 16,6% (19/114) para L. (L.) chagasi, 1,7% (2/114) para Leishmania sp., sugerindo ser L. amazonensis ou L. lainsoni, e 5,2% (6/114) continuaram como Leishmania sp.

Entretanto, no PCR de linfonodo, 7% (8/114) foram positivos, sendo 50% (4/8) para Leishmania sp. (L. amazonensis ou L. lainsoni), 25% (2/8) para L. (L.) chagasi e 25% (2/8) para Leishmania sp.

Do total de animais testados no estado de São Paulo, 4,2% (7/165) foram positivos para Leishmania do subgênero Viannia, 12,7% (21/165) para L. (L.) chagasi, 1,2% (2/165) para Leishmania spp., mas podendo ser L. amazonensis ou L. lainsoni, e 10,9% (18/165) continuaram como Leishmania sp. Na PCR de linfonodo, 25% (2/8) foram positivos para Leishmania spp. (L. amazonensis ou L. lainsoni) (Figura 58).

Para os animais da região amazônica, 5,2% (1/19) foram positivo para Leishmania spp., sendo este o animal P176, C. macrocephalus do Amazonas, BR-319. Na PCR de linfonodo, 25% (2/8) foram positivos para Leishmania sp.

(L. amazonensis ou L. lainsoni), 25% (2/8) para L. (L.) chagasi e 25% (2/8) para Leishmania spp (Figura 58).

A PCR-RFLP mostrou resultados iguais nos animais que tinham resultado positivo tanto na papa de leucócito como no linfonodo, como nos casos P040, P176.

Entretanto, nem toda amostra positiva no linfonodo foi positiva no sangue, fato este observado em 87,5% (7/8) dos animais positivos na PCR de linfonodo.

Figura 58 - Localização dos primatas positivos (pontos vermelhos) na PCR-RFLP utilizando como alvo o kDNA do cinetoplasto de Leishmania spp. A) Estado de São Paulo, 1- São Joaquim da Barra; 2- Patrocínio Paulista, 3- Bauru, 4- DEPAVE-CRAS, 5- Lorena, 6- PET, 7- DEPAVE-Ibirapuera, 8- CETAS UNIMONTE; B) Rondônia, Abunã; C) Amazonas, BR-319. - São Paulo/Amazônia – 2008 - 2012 1 2 3 4 6 5 7 8