Diagnóstico molecular

Devido à importância da introdução rápida do tratamento anti-T. cruzi, nos casos de reativação chagásica, para que haja melhora do bem estar dos pacientes e para se evitar formas graves de reinfecção, que levem ao comprometimento neurológico e/ou cardíaco, é imprescindível a utilização de um diagnóstico rápido com alta acurácia. Nesse sentido, estratégias moleculares têm surgido como ferramentas promissoras para o diagnóstico diferencial entre rejeição e reativação pós-transplante cardíaco, auxiliando na escolha do tratamento correto.

No presente estudo, avaliamos a possibilidade de utilização de metodologias baseadas em PCRs direcionadas para marcadores nucleares (rDNA 24Sα) e mitocondriais (kDNA), para o diagnóstico precoce da presença de T. cruzi nos tecidos de pacientes chagásicos transplantados. De 2008 a 2018, foram analisadas 991 BEMs, derivadas do acompanhamento pós-transplante cardíaco de 98 pacientes chagásicos, além de 14 biópsias de pele e três biópsias de sistema nervoso central (SNC), derivadas de casos de reativação cutânea ou neurológica. O DNA de T. cruzi foi detectado em 216 dessas amostras biológicas: 205 BEMs, oito biópsias de pele e três biópsias de SNC.

Tempo de sobrevivência- Meses

Sob reviv ê n cia a cu mu lat iva

Tempo de sobrevivência - Meses

Sob reviv ê n cia a cu mu lat iva Doença de Chagas NÃO SIM NÃO-censurado SIM- censurado Reativação chagásica NÃO SIM NÃO-censurado SIM- censurado A B

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Com a realização das duas metodologias de diagnóstico molecular, verificamos que a técnica da PCR tendo o alvo o kDNA é mais sensível do que a amplificação do rDNA — 184 BEMs positivas oriundas de 63 pacientes versus 117 BEMs positivas oriundas de 52 pacientes —, resultado que pode ser explicado tendo em vista a biologia do T. cruzi. Os minicírculos do kDNA estão presentes em múltiplas cópias, de 5.000 a 20.000, em cada célula do parasito (Simpson, 1987), enquanto o rDNA 24 Sα faz parte do DNA nuclear, possuindo cerca de 100 a 200 cópias no genoma (Simpson, 1987; Agabian, 1990).

Técnicas de PCR tendo como o alvo o kDNA já foram recusadas como estratégia diagnóstica para detecção de T. cruzi em BEMs de pacientes chagásicos em trabalhos anteriores, pois alguns pacientes sem sinais clínicos de reativação da doença de Chagas foram positivos para esse marcador. No entanto, como esses pacientes foram acompanhados por apenas 12 meses, não foi possível concluir se esses dados discrepantes representavam resultados de PCR falso-positivos ou antecipação de reativação clínica da doença (Benvenuti et al., 2011). Sendo assim, nós optamos pela associação de duas PCRs para o diagnóstico de T. cruzi, PCR do kDNA e PCR em tempo real do rDNA 24Sα, visando aumentar a sensibilidade diagnóstica sem perder especificidade, e também aumentamos o período de acompanhamento.

Todavia, uma boa correlação entre os resultados gerados pelas duas técnicas de PCR foi observada, como demonstrado pelo índice de correlação de Kappa=0,557 e p <0,001. Valores kappa variando de 0,75 a 0,40 são considerados como bom a razoável (Fleiss, 1981). Além disso, a utilização das duas metodologias foi essencial para o diagnóstico de todas as amostras positivas, visto que alguns pacientes que já apresentaram reativação clínica poderiam ter sido diagnosticados incorretamente utilizando apenas uma das técnicas. Sendo que 6,2% (4/65) e 10,8% (7/65) dos pacientes com reativação clínica foram diagnosticados apenas por rDNA 24Sα ou PCR do kDNA, respectivamente.

Os resultados das análises das primeiras 500 BEMs derivadas de 58 pacientes chagásicos submetidos ao transplante cardíaco, e a comparação da acurácia do diagnóstico molecular e dos métodos parasitológicos convencionais — análise histopatológica da BEM, esfregaço sanguíneo e hemocultura — resultaram na PUBLICAÇÃO 1 (Costa et al., 2017).

Neste trabalho, pudemos ver que os resultados para a metodologia de PCR adotada apresentaram considerável sensibilidade (82%) e especificidade (60%). Em contraste, apenas 26% dos pacientes com reativação da doença de Chagas pós-transplante foram

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positivos para a análise histopatológica convencional, mostrando a baixa sensibilidade desta técnica. A área sob a curva ROC, considerando os 58 pacientes, para o diagnóstico molecular e para histopatologia foram de 0,71 e 0,63 respectivamente (Figura 1.3A). Quando comparamos os resultados obtidos apenas para os pacientes que foram submetidos aos quatro tipos de métodos de diagnóstico analisados (29 dos 58 pacientes) observamos que a técnica de PCR também revelou sensibilidade superior a todas elas, apresentando valor de 0,79, enquanto análise histopatológica da BEM, esfregaço sanguíneo e hemocultura mostraram sensibilidade de 0,32, 0,37 e 0,26, respectivamente. A área sob a curva (AUC) ROC para o diagnóstico molecular, histopatologia, esfregaço sanguíneo e hemocultura foram de 0,695, 0,658, 0,684 e 0.582, respectivamente, indicando que o método descrito no presente estudo possui maior acurácia em relação aos outros testes (Figura 1.3B).

Figura 1.3 - Curvas ROC para comparação

Resultados semelhantes foram observados, quando a nossa análise foi ampliada para quase o dobro das amostras iniciais (991 BEMs). Considerando ambas os alvos para PCR, 205 BEMs positivas (20,7%) foram obtidas de 70 pacientes que apresentaram

Sensibilidade= 81,6 Especificidade= 60,0 AUC= 0,708 Sensibi li da de 100- Especificidade Sensibi li da de 100- Especificidade Sensibilidade= 26,3 Especificidade= 100 AUC= 0,632 Sensibilidade= 78,9 Especificidade= 60,0 AUC= 0,695 Sensibilidade= 31,6 Especificidade= 100 AUC= 0,658 Sensibilidade= 26,3 Especificidade= 90,0 AUC= 0,582 Sensibilidade= 36,8 Especificidade= 100 AUC= 0,684

Diagnóstico Molecular (BEM) Histopatologia (BEM) Esfregaço sanguíneo Hemocultura

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algum resultado afirmativo para pelo menos um dos testes moleculares realizados para diagnóstico. Desses pacientes, 51 (73%) já apresentaram pelo menos um episódio de reativação clínica da doença de Chagas ao decorrer dos anos de acompanhamento (variando entre 4 semanas e 4,4 anos), o que demonstra uma boa associação entre os resultados gerados em conjunto pelas PCRs com a reativação clínica da doença, conforme resumido na Figura 1.4.

Figura 1.4- Comparação dos resultados entre o diagnóstico molecular e a reativação clínica da doença de Chagas pós-transplante cardíaco.

Além disso, os primeiros resultados positivos para o diagnóstico molecular ocorreram entre uma semana e 20 meses pós-transplante, com média de 3,1 meses e mediana de um mês, antecipando a reativação clínica da doença de Chagas entre 1,5 e 36 meses, com mediana de 6 meses (9,1 meses, em média). Esses achados nos permitiram propor um algoritmo para vigilância da reativação chagásica baseada nos testes moleculares, que certamente contribuirá para o diagnóstico precoce de reativação chagásica com potencial para auxiliar nas decisões dos clínicos sobre as melhores opções de tratamento (Costa et al, 2017- PUBLICAÇÃO 1).