Diferenciação genética das populações - TRATAMENTO DOS DADOS E ANÁLISES

1 INTRODUÇÃO

4.4 TRATAMENTO DOS DADOS E ANÁLISES

4.4.4 Diferenciação genética das populações

Os testes exatos para diferenciação populacional foram realizados com o uso do programa GENEPOP® 3.4 (RAYMOND e ROUSSET, 1995a). Este utiliza Tabelas de contingência RxC geradas automaticamente para cada locus, em que R é o número de populações e C é o número de alelos no locus. Este procedimento compara cada locus em pares de populações, para determinar se existem diferenças nas frequências alélicas e genotípicas observadas, onde a hipótese nula testada é a de que a distribuição alélica é idêntica entre as populações (RAYMOND e ROUSSET, 1995b).

5 RESULTADOS

5.1 Frequências genotípicas, alélicas e Equilíbrio de Hardy- Weinberg

As frequências alélicas e genotípicas de cada um dos dois AIMs (APO e PV92) (Tabela 3 e 4).

Tabela 3: Frequências alélicas e genotípicas APO

Locus APO Casos (AR) Controles (PSC)

Ins 152 (0,760) 192 (0,960) Del 48 (0,240) 8 (0,040) Total de Alelos 200 200 Ins/Ins 63 (0,577) 93 (0,921) Ins/Del 26 (0,366) 6 (0,078) Del/Del 11 (0,057) 1 (0,001) Total de indivíduos 100 100

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Tabela 4: Frequências alélicas e genotípicas PV92

Locus PV92 Casos (AR) Controles (PSC)

Ins 91 (0,460) 58 (0,290) Del 107 (0,540) 142 (0,710) Total de Alelos 198 200 Ins/Ins 41 (0,208) 12 (0,083) Ins/Del 9 (0,504) 34 (0,414) Del/Del 49 (0,288) 54 (0,503) Total de indivíduos 99 100

As frequências genotípicas dos dois AIMs foram comparadas aos valores esperados pelo Equilíbrio de Hardy-Weinberg (Tabela 5) utilizando as frequências genotípicas esperadas (Tabela 6 e 7).

Tabela 5: Valores de p para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg. (Valores

em equilíbrio quando p >0,05). População APO PV92 A ARR 0,0057 0,0000* P PSSCC 0,1364 0,0884

* Valor fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg

Tabela 6: Tabela com frequência absoluta e esperada do marcador

APO. Genótipo Frequência Absoluta AR Frequência Absoluta PSC Total Desvio amostral AR Desvio amostral PSC In/In 63 (78) 93 (78) 156 2,8846 2,8846 In/Del 26 (16) 6 (16) 32 6,25 6,25 Del/Del 11 (6) 1 (6) 12 4,1666 4,1666 Total 100 100 200 X2(0,05)= 26,6025

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Tabela 7: Tabela com frequência absoluta e esperada do marcador

PV92. Genótipo Frequência Absoluta AR Frequência Absoluta PSC Total Desvio amostral AR Desvio amostral PSC In/In 41 (26,3668) 12 (26,6331) 53 8,1212 8,0399 In/Del 9 (21,3919) 34 (21,6080) 43 7,1783 8,5698 Del/Del 49 (51,2412) 54 (51,7587) 103 0,0980 0,2729 Total 99 100 199 X2(0,05)= 32,2801

5.2 ASSOCIAÇÃO ENTRE LOCI NÃO LIGADOS

Associações significativas entre loci não ligados são indicativas de desequilíbrio de ligação por mistura recente (ALD, do inglês

Admixture Linkage Disequilibrium) (PFAFF et al., 2001) e sugerem a

presença de estrutura genética, razão pela qual foi analisado o padrão de associações par a par entre os AIMs não ligados.

5.3 DIFERENCIAÇÃO POPULACIONAL

A diferenciação genética (alélica e genotípica) entre as populações de casos (AR) e controles (PSC) está descrita na tabela 8.

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Tabela 8: Valores de p para diferenciação alélica e genotípica entre as

populações de casos (AR) e controles (PSC).

Loci Diferenciação alélica

AR X PSC Diferenciação genotípica AR X PSC APO 00 00 P PVV9922 0,00072 0,00618 6 6 DDIISSCCUUSSSSÃÃOO

6.1 FREQUÊNCIAS ALÉLICAS, EQUILÍBRIO DE HARDY- WEINBERG E TESTE DE HOMOGENEIDADE

A frequência do alelo 1 do marcador APO foi maior no grupo amostral PSC do que o de controle, como mostra a figura 1. Em relação ao marcador PV92, foi o grupo amostral AR que teve uma frequência maior.

Figura 1: Gráfico com as frequências do alelo 1 para os dois

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Das frequências alélicas dos dois AIMs aqui analisados, o marcador APO no grupo amostral PSC apresenta as frequências próximas (0,960 – presente estudo) entre europeus (0,937 - BRUM et

al., 2013) e ameríndios (0,996 - MUNIZ et al., 2008), contudo para esse

marcador, foi o grupo amostral AR que teve a frequência (0,760 – presente estudo) mais próxima da população brasileira (0,770 - SHRIVER et al., 2003) Já o marcador PV92 no grupo amostral PSC apresenta uma frequência (0,290 – presente estudo) próxima da brasileira (0310 - SHRIVER et al., 2003), como mostra a figura 2.

Figura 2: Gráfico com as frequências do alelo 1 para os dois marcadores genéticos nos dois grupos amostrais comparados com a literatura.

Frequências retiradas da literatura: EU – BRUM et al, 2013; AM – MUNIZ et al, 2008; AF – PARRA et al, 1998; BR – SHRIVER et al, 2003.

Quando comparadas as frequências alélicas dos dois AIMs nas populações de controles deste trabalho, foram encontradas frequências semelhantes (APO 0,960 – presente estudo; 0,942 e 0,951 - ZEMBRZUSKI et al., 2006) (PV92 0,290 – presente estudo; 0,310 e 0,258 - BRUM et al., 2013) em outros dois estudos brasileiros

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(Apêndice F), sendo o primeiro envolvendo pacientes com Doença Arterial Coronariana e controles sem histórico de doença (ZEMBRZUSKI et al., 2006) e o segundo estudo envolvendo dois grupos de pacientes (um grupo diagnosticado com Neuromielite Óptica e o outro com Esclerose Múltipla) e seus controles sem histórico de doença (BRUM et al., 2013).

Considerando as duas populações de casos e controles aqui analisadas (AR e PSC) e os loci estudados, houve um desvio para o EHW (p<0,050) que foi observado no grupo amostral de casos (AR), o marcador PV92 (p=0.0000). O desvio observado poderia ser explicado por erro de genotipagem.

Foi realizado o Qui-Quadrado de homogeneidade, e tanto para o marcador APO como para o PV92, foi rejeitada a H0, ou seja, os dois grupos amostrais não são homogêneos quanto às classes fenotípicas. Para APO o X2 calculado (26,6025) foi bem maior do que o X2 tabelado (5,99), sendo que foram os heterozigotos (6,25 e 6,25) que mais contribuíram para o grupo amostral estar fora do equilíbrio. Para PV92 o X2 calculado (32,2801) foi bem maior do que o X2 tabelado (5,99), sendo que foram tanto os homozigotos de inserção (8,12 e 8,03) como os heterozigotos (7,17 e 8,56) que contribuíram para o grupo amostral ficar fora do equilíbrio.

6.2 ASSOCIAÇÃO ENTRE LOCI NÃO LIGADOS

O fluxo gênico entre populações geneticamente distintas gera ALD entre os loci (ligados e não ligados) que possuem diferentes frequências alélicas (HARTL e CLARK, 2010). Associações entre loci não ligados sugere miscigenação recente, sendo considerada tão mais recente quanto maior for ALD. Não foram observadas associações entre os loci para a população de casos e para a de controle.

6.3 DIFERENCIAÇÃO POPULACIONAL

A partir de testes exatos, foram encontradas diferenças alélicas e genotípicas entre as duas populações estudadas, ou seja, o valor de

p<0,05 tanto para a diferenciação alélica (APO – 0; PV92 – 0,00072)

como para a populacional (APO – 0; PV – 0,00618). Portanto, rejeita-se a hipótese de que os alelos e genótipos possuem a mesma distribuição em casos e controles, corroborando os dados anteriores que mostram que os dois grupos amostrais são diferentes.

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7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

As perspectivas incluem a incorporação de um número maior de AIMs para refinar as estimativas aqui apresentadas, auxiliar outros trabalhos que utilizem AIMs, aumentar o número de marcadores em futuros trabalhos do Laboratório de Polimorfismos Genéticos (LAPOGE/UFSC), aumentar o número de amostras a serem genotipadas

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8 RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAAS S

ARDLIE, K. G., KRUGLVAK, L., SEIELSTAD, M. Patterns of linkage disequilibrium in the human genome. Nature Reviews Genetics, v. 3, n. 4, p. 299-309, 2002.

BEDOYA, G.; MONTOYA, P.; GARCIA, J.; SOTO, I.; BOURGEOIS, S.; CARVAJAL, L.; LABUDA, D.; ALVAREZ, V.; OSPINA, J.; HEDRICK, P.W.; RUIZ-LINARES, A. Admixture dynamics in Hispanics: A shift in the nuclear genetic ancestry of a South American population isolate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 103, n. 19, p. 7234-9, 2006.

BODMER, W.F., CAVALLI-SFORZA, L. L.; HENDRICK, A. E. Fear of enlightenment. Nature, v.229, n. 5279, p. 72-1, 1971.

BRUM, D. G.; LUIZON, M. R.; SANTOS, A. C. et al. European ancestry predominates in neuromyelitis optica and multiple sclerosis patients from Brazil. PloS one, v. 8, n. 3,p. e58925, 2013.

BURCHARD, E. G.; ZIV, E.; COYLE, N. et al. The importance of race and ethnic background in biomedical research and clinical practice. The New England journal of medicine, v. 348, n. 12, p. 1170-5, 2003.

CAVALLI-SFORZA, L. L. The DNA revolution in population genetics. Trends in genetics: TIG, v. 14, n. 2, p. 60-5, 1998.

CHEN, H.; ZHU, X.; ZHAO, H.; ZHANG, S. Qualitative Semi- Parametric Test for Genetic Associations in Case-Control Designs Under. Annals of human genetics, v. 2, p. 250-264, 2003.

COLLINS-SCHRAMM, H. E., CHIMA, B., OPERARIO, D. J., CRISWELL, L., SELDIN, M. F. Markers informative for ancestry demonstrate consistent megabase-length linkage disequilibrium in the African American population. Human genetics, v. 113, n. 3, p. 211-219, 2003.

GERENT,2013 AIMs em Santa Catarina

24

COLLINS-SCHRAMM, H. E.; PHILLIPS, C. M.; OPERARIO, D. J.

et al. Ethnic-difference markers for use in mapping by admixture

linkage disequilibrium. American journal of human genetics, v. 70, n. 3, p. 737-50, 2002.

DEBORTOLI, G. Identificação de quarto marcadores

informativos de ancestralidade para fins de estudos de caso- controle. Dissertação de mestrado, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2013.

FLORES, M. B. R. Povoadores da fronteira: os casais açorianos rumo ao sul do Brasil. Florianópolis: UFSC, 2000.

GABRIEL, S. B., SCHAFFNER, S. F., NGUYEN, H., MOORE, J. M., ROY, J., BLUMENSTIEL, B., HIGGINS, J., DEFELICE, M., LOCHNER, A., FAGGART, M., LIU-CORDERO, S. N., ROTIMI, C., ADEYEMO, A., COOPER, R., WARD, R., LANDER, E. S., DALY, M. J., ALTSHULER, D. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science, v. 296, n. 5576, p. 2225-2229, 2002. HALDER, I.; SHRIVER, M.; THOMAS, M.; FERNANDEZ, J. R.; FRUDAKIS, T. A panel of ancestry informative markers for estimating individual biogeographical ancestry and admixture from four continents: utility and applications. Human mutation, v. 29, n. 5, p. 648-58, 2008.

HALDER, I., SHRIVER, M. D. Measuring and using admixture to study the genetics of complex diseases. Human genomics, v. 1, n. 1, p. 52-62, 2003.

HARTL, D.L.; CLARK, A.G. Principles of population genetics. 4th ed. Sinauer Associates, Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts, 2010.

HOGGART, C.J.; PARRA, E.J.; SHRIVER, M.D.; BONILLA, C.; KITTLES, R.A.; CLAYTON, D.G.; MCLEIGUE, P.M. Control of confounding of genetic associations in stratified populations. Am J Hum Genet., v. 72, p. 1492–1504, 2003.

GERENT,2013 AIMs em Santa Catarina

25

HUTTLEY, G. A., SMITH, M. W., CARRINGTON, M., O’BRIEN, S. J. A Scan for Linkage Disequilibrium Across the Human Genome. Genetics, v. 152, p. 1711-1722, 1999.

JORDE, L. B. Linkage disequilibrium as a gene-mapping tool. Am J Hum Genet., v. 56, n.1, p. 11-14, 1995.

KLEIN, H.S. Migração internacional na história das Américas. In Fausto, B. Fazer a América. Ed. Universidade de São Paulo, p 13-31, 2000.

LUIZON, M. R.; MENDES-JUNIOR, C. T.; DE OLIVEIRA, S. F. et

al. Ancestry informative markers in Amerindians from Brazilian

Amazon. American journal of human biology : the official journal of the Human Biology Council, v. 20, n. 1,p. 86–90, 2008. LUIZON, M. R. Dinâmica da Mistura Étnica em Comunidades Remanescentes de Quilombo Brasileiras. Tese de Doutorado, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.

MAO, X.; BIGHAM, A. W.; MEI, R. et al. A genomewide admixture mapping panel for Hispanic/Latino populations. American journal of human genetics, v. 80, n. 6, p. 1171-8, 2007. MARRERO, A. R.; SILVA-JUNIOR, W.A.; BRAVI, C.M.; HUTZ, M.H.; PETZL-ERLER, M.L.; RUIZ-LINARES, A.; SALZANO, FRANCISCO M., et al. Demographic and evolutionary trajectories of the Guarani and Kaingang natives of Brazil. American journal of physical anthropology, v. 132, n. 2, p. 301-10, 2007.

MARTINEZ-FIERRO, M.L.; BEUTEN, J.; LEACH, R.J.; PARRA, E.J.; CRUZ-LOPEZ, M.; RANGEL-VILLALOBOS, H.; RIEGO- RUIZ, L.R.; ORTIZ-LOPEZ, R.; MARTINEZ-RODRIGUEZ, H.G.; ROJAS-MARTINEZ, A Ancestry informative markers and admixture proportions in northeastern Mexico. Journal of Human Genetics, v. 54, n. 9: p. 504-9, 2009.

GERENT,2013 AIMs em Santa Catarina

26

MILLER, S.A.; DYKES, D.D.; POLESKY, H.F. A simple salting out procedure for extraction DNA from human nucleated cell. Nucleic Acids Research, n. 16, p. 1215, 1988.

MILLS, R. E.; LUTTIG, C. T.; LARKINS, C. E. et al. An initial map of insertion and deletion (INDEL) variation in the human genome. Genome research, v. 16, n. 9, p. 1182-90, 2006.

MUNIZ, Y. C. N. Marcadores Genéticos de Ancestralidade em Comunidades Fundadas por Açorianos na Ilha de Santa Catarina. Tese de Doutorado, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

PARRA, E. J.; MARCINI, A.; AKEY, Jet al. Estimating African American admixture proportions by use of population-specific alleles. American journal of human genetics, v. 63, n. 6, p. 1839–51, 1998.

PRICE, A. L.; PATTERSON, N.; YU, F. et al. A genomewide admixture map for Latino populations. American journal of human genetics, v. 80, n. 6, p. 1024-36, 2007.

PRITCHARD, J. K., PRZEWORSKI, M. Linkage Disequilibrium in Humans: Models and Data. Am J Hum Genet., v. 69, p. 1-14, 2001. RAYMOND, M.; ROUSSET, F. GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact test and ecumenism. J Hered 86: 248-249, 1995a.

RAYMOND, M.; ROUSSET, F. An exact test for population differentiation. Evolution 49: 1280-1283, 1995b.

REICH, D. E.; GOLDSTEIN, D. B. Detecting association in a case- control study while correcting for population stratification. Genetic epidemiology, v. 20, n. 1, p. 4-16, 2001.

REINER, A. P.; ZIV, E.; LIND, D. L. et al. Population structure, admixture, and aging-related phenotypes in African American adults:

GERENT,2013 AIMs em Santa Catarina

27

the Cardiovascular Health Study. American journal of human genetics, v. 76, n. 3, p. 463-77, 2005.

RIBEIRO, D. O povo brasileiro: a formação e o sentido do Brasil. Companhia das Letras, São Paulo, 1995.

RIBEIRO, M.A. C-Reactive Protein: Re-evaluation of a Diagnostic Laboratory Test. Braz J Infect Dis., v. 5, p. 212-225, 1997.

RISCH, N., MERIKANGAS, K. The future of genetic studies of complex human diseases. Science, v. 273, n. 5281, p. 1516-1517, 1996.

ROSENBERG, N. A.; HUANG, L.; JEWETT, E. M. et al. Genome- wide association studies in diverse populations. Nature Reviews Genetics, v. 11, n. 5, p. 356-366, 2010.

ROSENBERG, NOAH A; PRITCHARD, JONATHAN K; WEBER, J. L. et al. Genetic structure of human populations. Science (New York, N.Y.), v. 298, n. 5602, p. 2381-5, 2002.

SACHIDANANDAM, R.; WEISSMAN, D.; SCHMIDT, S. C. et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature, v. 409, n. 6822, p. 928- 33, 2001.

SALZANO, F. M.; FREIRE-MAIA, N. Problems in human biology: a study of Brazilian populations. Detroit, Wayne State University Press, 1970.

SCHIAVETTO, S. N. A arqueologia Guarani : construção e desconstrução daidentidade indigena. 2003.

SELDIN, M. F.; MORII, T.; COLLINS-SCHRAMM, H. E. et al. Putative ancestral origins of chromosomal segments in individual african americans: implications for admixture mapping. Genome research, v. 14, n. 6, p. 1076-84, 2004.

GERENT,2013 AIMs em Santa Catarina

28

SHRIVER, M. D.; PARRA, E. J.; DIOS, S. et al. Skin pigmentation, biogeographical ancestry and admixture mapping. Human genetics, v. 112, n. 4, p. 387–99, 2003.

SHRIVER, M. D. Ethnic variation as a key to the biology of human disease. Ann Intern Med, v. 127, n. 5, p. 401-3, 1997.

SILVA, M. C. F., ZUCCHERATO, L. W., SOARES-SOUZA, G. B., VIEIRA, Z. M., CABRERA, L., HERRERA, P., BALQUI, J., ROMERO, C., JAHUIRA, H., GILMAN, R. H., MARTINS, M. L., TARAZONA-SANTOS, E. Development of two multiplex mini- sequencing panels of ancestry informative SNPs for studies in Latin Americans: an application to populations of the State of Minas Gerais (Brazil). Genetics and molecular research, v. 9, n. 4, p. 2069-2085, 2010.

SMITH, M. W.; PATTERSON, N.; LAUTENBERGER, J. A; et al. A high-density admixture map for disease gene discovery in african americans. American journal of human genetics, v. 74, n. 5, p. 1001-13, 2004.

TANG, H., QUERTERMOUS, T., RODRIGUEZ, B., KARDIA, S. L. R., ZHU, X., BROWN, A., PANKOW, J. S., PROVINCE, M., HUNT, S. C., BOERWINKLE, E., SCHORK, N. J., RISCH, N. J. Genetic structure, self-identified race/ethnicity, and confounding in case-control association studies. American journal of human genetics, v. 76, n. 2, p. 268-275, 2005.

TARAZONA-SANTOS, E.M.; RAIMONDI, s.; FUSELLI, S. Controlling the effects of population stratification by admixture in pharmacogenomics. In: Suarez-Kurtz G (Ed.). Pharmacogenomics in admixed populations. Landes Bioscience, Austin, Estados Unidos, p 1-16, 2007.

TAVARES, L. H. D. Comércio proibido de escravos. São Paulo, Ática, 1988.

GERENT,2013 AIMs em Santa Catarina

29

TAUTZ, D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research, v. 17, n. 16, p. 6463-6471, 1989.

THE INTERNATIONAL HAPMAP CONSORTIUM. A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Nature, v. 449, p. 851-861, 2007.

TIAN, C.; HINDS, D. A.; SHIGETA, R. et al. ARTICLE A Genomewide Single-Nucleotide – Polymorphism Panel with High Ancestry Information for African American Admixture Mapping. The American Journal of Human Genetics, v. 79, n. October, p. 640-649, 2006.

TIAN, C.; HINDS, D. A.; SHIGETA, R. et al. A Genomewide Single-Nucleotide–Polymorphism Panel for Mexican American Admixture Mapping. The American Journal of Human Genetics, v. 80, n. 6, p. 1014-1023, 2007.

WEBER, P.; CAMMAS, F.; GERARD, C. et al. Germ cell expression of the transcriptional co-repressor TIF1β is required for the maintenance of spermatogenesis in the mouse. Development, v. 2337, p. 2329-2337, 2002.

WEISS, K., CLARK, A. Linkage disequilibrium and the mapping of complex human traits. Trends in Genetics, v. 18, n. 1, p. 19-24, 2002.

WINKLER, C. A., NELSON, G. W., SMITH, M. W. Admixture mapping comes of age. Annual review of genomics and human genetics, v. 11, p. 65-89, 2010.

ZEMBRZUSKI, V. M.; CALLEGARI-JACQUES, S. M.; HUTZ, M. H. Application of an African Ancestry Index as a genomic control approach in a Brazilian population. Annals of human genetics, v. 70, n. Pt 6, p. 822–8, 2006.

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30

APÊNDICE A - Questionário aplicado nos pacientes com Artrite Reumatóide

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APÊNDICE C – Termo de consentimento livre esclarecido, indivíduos-controles

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APENDICE D – Termo de consentimento livre e esclarecido ao paciente com artrite

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APENDICE E – Metodologia de extração genômica e PCR Extração do DNA genômico

As amostras de sangue periférico foram centrifugadas (Centrifugue 206 BL Excelsa II®) a 3000g (1835rpm) durante 15 min a temperatura ambiente (TA) para a separação dos componentes sanguíneos. Após a centrifugação, foram separados o plasma, o concentrado de hemácias e a camada de leucócitos. Esses componentes sanguíneos foram aliquotados, identificados e estocados a -20°C. Os leucócitos foram utilizados para a extração do DNA genômico. O plasma e o concentrado de hemácias não foram utilizados nesse estudo. Reagentes e Soluções

1) Solução de Lise I (Tris-HCl 0,01M, Amresco®; Sacarose 0,32M,

Merck®; MgCl2 0,0025M; Triton X 100 – 1%, Nuclear®);

2) Solução de Lise II (Tris-HCl 0,01M, Amresco®; KCl 0,05M,

Vetec®); MgCl2 0,0025M, Nuclear®); Nonidet – 1%, Amresco®;

TWEEN 20 – 1%, Amresco®); 3) SDS 10%(Amresco®);

4) Solução de Perclorato de Sódio 5,0M (Vetec®); 5) Solução Saturada de NaCl 6,0M (Nuclear®); 6) TE (Tris-HCl 1M, Amresco®; EDTA 0,5M, Vetec®);

7) Álcool Isopropílico Absoluto, TA- Temperatura Ambiente (Merck®); 8) Etanol 70%, TA (Merck®).

Procedimento

A extração de DNA foi realizada através de um método de

Salting Out modificado, baseado em Miller et al. (1988). Para cada

amostra, foram colocados 100μL da camada de leucócitos em microtubos de polipropileno de 1,5mL (tipo eppendorf), utilizando-se uma micropipeta e ponteiras estéreis. Em seguida, adicionou-se

1,0mL Solução de Lise I em cada um desses microtubos. As amostras foram homogeneizadas e centrifugadas (Centrifugue 5415D, Eppendorf®) a 13400g (12000rpm) durante 4 min a TA. O sobrenadante foi descartado e, este procedimento foi repetido (de 3 a 4 vezes) até que os glóbulos vermelhos fossem removidos e o precipitado apresentasse cor branca, indicando a presença dos glóbulos brancos.

Posteriormente, foi acrescentado ao precipitado de leucócitos 300μL de Solução de Lise II, 10μL de SDS 10% e 75μL de Perclorato

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de Sódio 5M. As amostras foram agitadas em um agitador de tubos, do tipo vórtex, e a cada tubo foi acrescentado 130μL de NaCl 6M e, a seguir, as amostras foram centrifugadas a 13400g por 5 min a TA. Novos microtubos de 1,5mL foram identificados e, para esses, foram transferidos os sobrenadantes resultantes da centrifugação. Ao sobrenadante foram adicionados 300μL de Álcool Isopropílico Absoluto e as amostras foram, novamente, centrifugadas a 13400g por 15 min.

O sobrenadante foi descartado e ao precipitado foi acrescentado 300μL de Etanol 70%. As amostras foram centrifugadas a 13400g por 5 min, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi seco, a temperatura ambiente, overnight. Após a secagem dos precipitados, foi adicionado a cada tubo 100 μL de TE. As amostras foram colocadas no banho-maria a 56°C, por 30 min e, posteriormente, armazenadas a - 20°C.

Reação em Cadeia da Polimerase

Reagentes e Soluções

1) Água Ultrapura;

2) dNTPs solução estoque: quatro soluções separadas de 100mM de cada base (dATP,dCTP, dGTP, dTTP), pH 8,3 (Invitrogen®);

3) dNTP solução de trabalho (20mM): obtida diluindo-se com água a solução estoque (100mM) de cada dNTP para uma solução única de concentração 20mM (160 μL de água de MiliQ autoclavada mais 10 μL da solução estoque de cada dNTP);

4) MgCl2 1,5mM (50mM, Invitrogen®);

5) Tampão de PCR 10X (0,2M Tris-HCl pH 8,5; 0,5M KCl; Invitrogen®);

6) Iniciadores (Primers) específicos – solução estoque (100 μM): os primers liofilizados (IDT®) Foward e Reverse específicos para cada AIM foram diluídos em água autoclavada, e estocados separadamente; 7) Iniciadores (Primers) – solução trabalho (2,5 μM): 10 μL do primer Foward, 10 μL do primer Reverse e 180 μL de água auto-clavada; 8) Taq DNA Polymerase Platinum (0,5U/μL; Invitrogen®);

Procedimento

Os ensaios da PCR foram realizados em um volume total de 25 μL. Todos os reagentes (Água, Tampão, dNTP – solução trabalho,

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primers – solução trabalho, MgCl2 e a TaqPlatinum DNA polimerase), com exceção do DNA, foram misturados para cada locus em um único tubo de 0,6 μL (mistura de reação) para garantir a homogeneidade das reações. O cálculo para uma reação foi: 16,15 μL de água; 2,5 μL de Tampão de PCR; 0,25 μL de dNTP (solução trabalho); 1,00 μL de MgCl2; 2,00 μL de Primers (solução trabalho) e 0,1 μL de TaqPlatinum Polimerase. Após feito o mix de reação, 22μL da solução de reação são pipetados e distribuídos em tudos de 0,2 μL.

Em cada microtubo de 0,2 μL foram pipetados 3 μL do DNA genômico, previamente extraído. Para cada análise foi usado como controle negativo contendo água no lugar do DNA genômico. Em cada microtubo, sob a amostra, foram pipetados 22 μL da mistura de reação.

Os termocicladores utilizados foram o Mastercycler, Eppendorf® e MyCycler, Bio-Rad®. A este passo seguiu-se o programa correspondente a cada locus (Tabela 9). Após o término da reação de PCR o produto da PCR foi guardado em geladeira (4ºC) até sua utilização.

Condições de PCR

Após um passo inicial de desnaturação de 5 min a 94ºC, as amostras foram amplificadas por 30 ciclos nas temperaturas de desnaturação/pareamento/extensão especificadas (ToC PCR) para cada

loci, seguidos por um passo final de extensão por 5 min a 72ºC. A

menos que indicado em PCR - NOTAS, os passos de desnaturação/ pareamento/extensão foram respectivamente: 45 seg; 1min e 1 min.

Tabela 9: Condições de PCR dos dois AIMs analisados

4.4.2 Análise dos produtos amplificados

Reagentes e Soluções

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2)Tampão TBE 1X (100mL do Tampão TBE 10X; 900mL H2O); 3) Água Ultrapura;

4)Peso Molecular de 100pb (BioLabs®)

5) GelRed® Nucleic Acid Gel Stain (Biotium Inc.)

6)Tampão de Aplicação de Amostras (900 μL de Bromofenol, Merck®; 900 μL Xilenocianol, Sigma-Aldrich®; 900 μL TBE; 4,5mL Ficoll 30% diluído em H2O, Sigma-Aldrich®; 1,8mL EDTA 0,5M pH 8,0, Vetec®; 3,6g Sacarose, Merck®)

Procedimento

Os produtos amplificados foram visualizados através de eletroforese em gel de Agarose a 1,5%. Estes géis foram feitos

adicionando: 40,0 mL de TBE 0,5%; 0,6 g de Agarose. Essa solução foi colocada em suporte específico para a solidificação do gel e, após este processo, a placa contendo o gel foi encaixada na cuba de eletroforese modelo BIOAHS-12G (Bioamerica Inc.).

As amostras foram preparadas da seguinte forma: 6,0μL de produto de PCR; 1μL de mix de aplicação contendo 0,3 μL de GelRed; 0,3 μL de Tampão de Aplicação de Amostras e 4,0 μL de Água Ultrapura); e, posteriormente, aplicadas no gel. No primeiro poço foi colocado o padrão de peso molecular de 100pb para, posteriormente, ser comparado com as bandas amplificadas.

A corrida foi realizada, durante 50min, e a fonte de eletroforese (CBS, Scientific Company, Modelo EPS 4000) foi regulada de maneira que, a Voltagem (V) ficou fixa em 85 e, a Amperagem (mA) e a Potência (W) ficaram livres.

Leitura dos resultados no gel de agarose

O modo de visualização dos fragmentos de DNA para a detecção e anotação dos AIMs do tipo Inserção Alu (APO, PV92) está representado na figura 3. Nessa figura, é possível observar a presença de uma inserção Alu homozigota (raia 4), inserção/deleção (raias 1, 2 e 3),

No documento Utilização de dois marcadores informativos de ancestralidade para estudos de caso-controle (páginas 38-78)