Efeito de diferentes solventes sobre a atividade enzimática A estabilidade em solventes orgânicos é uma característica

importante das lipases e pode determinar a forma na qual a enzima será utilizada, por exemplo, como catalisador em reações de síntese orgânica. O fato é que a maioria das lipases de origem microbiana é ativa em interfaces hidrofílicas-lipolíticas e toleram solventes orgânicos em diversos tipos de reações. Essas propriedades fazem das lipases o grupo de biocatalisadores mais utilizados em química orgânica (SAID e PIETRO, 2004). A escolha de um solvente para ser utilizado em sistemas de biocatálise está diretamente relacionada à sua hidrofobicidade. Para classificar os solventes em relação a esta característica, o parâmetro mais utilizado é o coeficiente de partição (log P). O log P é calculado com base no logaritmo do coeficiente de partição de um solvente em um sistema padrão octanol/água. Em outras palavras, o log P é a razão entre as concentrações do solvente na fase orgânica e aquosa. Segundo Zaks e Klibanov (1985), solventes hidrofílicos (-2,5 < log P < 0), tais como acetona e éteres, são incompatíveis com a atividade enzimática devido à remoção de água de solvatação da estrutura proteica.

importância em se caracterizar a atividade enzimática da lipase produzida pelo isolado fúngico frente a diferentes solventes. Na Tabela III.3 é possível observar os valores de log P dos solventes testados nesse trabalho.

Tabela III.3 - Valores de log P para os solventes utilizados neste trabalho. Solvente Log P Metanol -0,82 Etanol -0,24 Acetona -0,23 Éter etílico 0,83 Clorofórmio 2,00 Hexano 3,50 Heptano 4,00

Através dos resultados obtidos e ilustrados nas Figuras III.14,III.15,III.16 e III.17, foi possível observar que o solvente que provocou maior declínio da atividade enzimática foi a acetona (Figura III.15B).

De fato, neste caso, a imobilização da enzima não acarretou no aumento da vida útil da mesma. Curiosamente, a acetona não foi o solvente mais polar testado, porém foi o que acarretou no maior declínio da atividade das enzimas. Este mesmo comportamento foi observado por Essamri, Deyris e Comeau (1998), que analisaram a atividade enzimática da lipase produzida por Rhizopus oryzae em solventes com polaridades diferentes. No referido trabalho, a acetona foi o solvente que acarretou na maior desnaturação da enzima, enquanto que o hexano foi o solvente em que obteve os maiores atividades enzimáticas ao longo de um período de 8 dias (Figura III.14A). Segundo esses mesmos autores, o comportamento ocorreu porque as lipases possuem pouca compatibilidade em solventes hidrofílicos, mas, possuem alta compatibilidade com solventes hidrofóbicos, pois os mesmos retêm a atividade enzimática por não removerem moléculas de água de

solvatação da superfície da enzima. No trabalho de Karra-Châabouni et al. (2008), que realizou a caracterização da lipase de Rhizopus oryzae em fibras de celulose frente a diferentes solventes, este comportamento também foi observado. Os autores citados verificaram que a lipase sofreu completa perda de atividade após 120 minutos de incubação com acetona e sofreu perda de 50% de atividade enzimática na presença de acetonitrila. A explicação para esse comportamento, dada pelos autores, também foi baseada no fato de tais solventes serem polares e interagirem com a água de solvatação da superfície da enzima.

Fazendo-se uma análise comparativa entre o hexano e o heptano que possuem valores de log P semelhantes, foi possível verificar que o hexano proporcionou maior estabilidade dos valores de atividade relativa25 _{da enzima frente ao heptano, apesar de, em princípio, a} atividade enzimática com o heptano ter sido maior. Inicialmente a atividade enzimática do heptano foi de 98,4% e do hexano foi de 91%. Esses resultados corroboram o trabalho de Essamri, Deyris e Comeau (1998), que também observaram o mesmo fenômeno. Por outro lado, outros trabalhos indicam que o heptano muitas vezes promove ativação da enzima. Tal afirmação pode ser ilustrada no trabalho de Baron (2008). Nesse caso, o heptano ativou a enzima de Bacillus megaterium, proporcionando uma atividade relativa de 121% da enzima quando comparado ao tampão fosfato pH 8,0, que foi utilizado como referência nesse trabalho. O trabalho de Lima et al. (2004) ilustra um estudo de estabilidade da lipase contida em caldo bruto de Penicillium aurantiogriseum em diferentes solventes. Os solventes hidrofóbicos, especialmente o heptano, foram capazes de ativar a enzima deixando-a com uma atividade relativa de 113,6%. Segundo Zaks e Klibanov (1985), solventes hidrofóbicos não prejudicam a atividade e podem até promover ativação enzimática, pois os mesmos não removem moléculas de água da superfície da enzima e podem interagir com a enzima mantendo a lid (tampa hidrofóbica) aberta. Por outro lado, esse argumento não pode ser utilizado em todos os casos, pois, segundo Verger (1997), em algumas enzimas a lid não está necessariamente relacionada com a ativação interfacial.

O fato do hexano propiciar maior estabilidade da enzima em 25 Neste caso, a atividade relativa tratou-se do valor obtido para a razão entre a atividade enzimática final (analisada após 2, 4 e 6 dias incubação em diferentes solventes) e atividade enzimática inicial (atividade enzimática analisada imediatamente após a adição dos solventes).

relação ao heptano é um comportamento curioso. Segundo Illanes (2008), além do fato da lid não estar presente em diversos tipos de lipases, é preciso verificar a quantidade de água na reação. Assim, é válido comentar que, nesta tese, a atividade enzimática foi avaliada com base em uma reação de hidrólise e, consequentemente, um possível deslocamento do equilíbrio da reação, no sentido da esterificação pode ter sido favorecido com o uso do hexano 50% (v/v). O equilíbrio da reação é controlado pela quantidade de água presente na mistura reacional. Com base no fato de que a pressão de vapor do hexano é 3,6 vezes maior que a do heptano, é possível dizer que os maiores valores de atividades enzimáticas foram obtidos para o hexano devido ao deslocamento do equilíbrio da reação. Outro fato é que os resultados poderiam ser muito diferentes caso a atividade sintética tivesse sido adotada para essa caracterização, ao invés da atividade de hidrólise.

(B)

Figura III.14 - Efeito de hexano (A) e heptano (B) em relação à atividade enzimática relativa da enzima livre (símbolo aberto) e a enzima imobilizada (símbolo fechado) a 25 ºC.

Ao analisar os dados referentes às atividades enzimáticas residuais após incubação com metanol, etanol, clorofórmio, éter e acetona (Figuras III.15, III.16 e III.17), foi possível verificar que o etanol foi o solvente que manteve a atividade enzimática pelo maior período de tempo, seguido pelo metanol. Foi possível fazer essa observação porque no sexto dia após incubação com etanol e metanol a enzima imobilizada detinha atividade residual de 54,2 e 49,9%. Tais constatações corroboram o trabalho de Castro-Ochoa et al. (2005), que caracterizou a lipase de Bacillus thermoleovorans. Os autores verificaram que a mesma apresentou uma elevada estabilidade em solventes polares, pois após 2 horas de incubação com 70% (v/v) de etanol e metanol a atividade residual foi de 71,8 e 65,7%, respectivamente. Segundo os mesmos autores, é possível que uma fina camada de moléculas de água permaneça fortemente ligada à enzima atuando como uma capa protetora ao longo de superfície hidrofílica da enzima e permitindo a retenção da conformação nativa. Por outro lado, no trabalho de Lock (2007), a lipase de Debaryomyces melissophillus foi muito sensível na presença de etanol e metanol. Apresentou baixa atividade com apenas 5% para metanol e atividade nula para 5% de

etanol.

O fato da enzima, nesta tese, possuir razoável estabilidade frente aos solventes polares pode estar associado ao processo de imobilização. Esse processo protege a enzima, tornando-a mais tolerante à polaridade e impedindo que os solventes polares retirem a água essencial em torno da molécula (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).

(A)

(B)

enzimática relativa da enzima livre (símbolo aberto) e da enzima imobilizada (símbolo fechado) a 25 ºC.

(A)

(B)

Figura III.16 - Efeito de Clorofórmio (A) e Etanol (B) em relação à atividade enzimática relativa da enzima livre (símbolo aberto) e a enzima imobilizada (símbolo fechado) a 25 ºC.

teve seu tempo de vida aumentado frente ao glutaraldeído. Com base na Figura III.17B, é possível verificar que foram obtidos valores de até 79% de retenção de atividade enzimática após seis dias de incubação com a enzima na forma imobilizada. É válido comentar que o glutaraldeído (um dialdeído) é utilizado em processos de imobilização de proteínas e também como agente reticulante. A reticulação ocorre quando cadeias poliméricas são interligadas através de ligações covalentes produzindo polímeros tridimensionais com elevados valores de massa molar (BEPPU; ARRUDA; SANTANA, 1999). Além disso, solução alcalina de glutaraldeído é extensivamente utilizada em processos de desinfecção e esterilização em hospitais e ambulatórios. Os mecanismos que tornam o glutaraldeído um importante agente desinfetante estão relacionados a reações de alquilação de grupos sulfidrilas, hidroxilas, carbonilas e amino de moléculas de DNA, RNA e proteínas dos micro-organismos. Outro tipo de reação ocorrida, especialmente no pH alcalino, é a formação de bases de Shiff através do ataque no nitrogênio nucleofílico no grupo amino (-NH2) que reage com o carbono do aldeído, formando uma ligação C=N. Em pHs ácidos a nucleofilicidade do nitrogênio do grupo amino é reduzida significativamente (COSTA JUNIOR; MANSUR, 2008). Apesar de todas as reações citadas promovidas pela ação do glutaraldeído, foi possível verificar que a enzima na forma imobilizada manteve seus grupos e sua estrutura protegida.

(B)

Figura III.17 - Efeito de Metanol (A) e Glutaraldeído (B) em relação à atividade enzimática relativa da enzima livre (símbolo aberto) e a enzima imobilizada (símbolo fechado) a 25 ºC.

III.5.3.4 Efeito de diferentes íons sobre a atividade enzimática