Dinâmica sazonal e circadiana da Piper arboreum

A sucessão de dias e noites em ciclos de 24 horas constitui um dos fatores ambientais desde o início da história da vida na Terra. Todos os organismos vivos exibem oscilações biológicas endógenas com o período de aproximadamente 24 horas, e contam o tempo com relógio sincronizado por sinais externos, como as variações ambientais, principalmente as de luz e temperatura. A regulação de funções biológicas pelo relógio circadiano tem a finalidade de otimizar os processos celulares e fisiológicos em antecipação a modificações periódicas no ambiente de um organismo (KERBAUY, 2008).

As plantas possuem um relógio circadiano que lhes permitem coordenar eventos biológicos internos com mudanças diárias externas. O relógio circadiano fornece a capacidade de antecipar a previsão diária e as mudanças sazonais que ocorrem no ambiente como uma consequência da rotação da terra (IMAIZUMI, 2010; FU et al., 2014), e apresentam duas características essenciais: o arrastamento para um ciclo ambiental e sustentabilidade rítmica sob condições constantes (GUERRIERO et al., 2012).

Alguns fatores ambientais como temperatura, disponibilidade hídrica, solo, sazonalidade, desenvolvimento da planta, altitude, entre outros, podem influenciar diretamente na dinâmica envolvida na produção de um metabólito secundário (GOBBO-NETO e LOPES, 2007). As reações enzimáticas decorrentes do metabolismo estão relacionadas diretamente com a luz e a temperatura (GOTTLIEB, et al 1996; GOTTLIEB e BORIN, 2012).

A análise das variações circadiana e sazonal na espécie Piper arboreum mostra o acúmulo da piperilina no período de um dia e durante um ano, respectivamente. Para isto, foi construída uma curva de calibração utilizando-se sete pontos da solução padrão em metanol nas concentrações de 5 a 100 µg/mL O coeficiente de correlação médio da concentração foi 0,9985. A curva de calibração obtida pelo método dos mínimos quadrados foi expressa pela equação y = 202411x – 791903 (Figura 34, p.98).

A quantificação da piperilina, nas folhas de P. arboreum, foi realizada com base nas área relativas para cada pico (área do pico/área do padrão). A concentração da amida foi calculada inserindo as áreas relativas na equação obtida para a curva de calibração. Os cromatogramas (Figura 35, p. 99; Figura 36, p. 100) mostram o resultado destas análises, e possibilitaram a verificação do acúmulo da amida no período de um dia e durante um ano.

Figura 35: Cromatogramas (UV 344 nm) para quantificação circadiana da piperilina (1) nos extratos das folhas de P. arboreum. 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 min 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 uV(x1,000,000) 8h 77h 74h 25h 23h 52h 55h 77h piperilina (1) 7

-5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 min 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 uV(x1,000,000)

jan

fev

mar

abr

jun

jul

mai

ago

dez

out

nov

set

Figura 36: Cromatogramas (UV 344 nm) para quantificação sazonal da piperilina (1) nos extratos das folhas de P. arboreum.

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A variação sazonal da concentração da amidas pirrolidínicas, pode estar relacionada com a precipitação média anual (período de chuva) observada para o período da coleta das folhas. No mês de janeiro observou-se um maior volume de chuva e consequentemente um aumento expressivo da piperilina nas folhas de P. arboreum. No entanto, para o mês de agosto, ocorreu uma menor precipitação, sendo observado, também, um menor acúmulo do metabólito (Figura 37-A, p. 103).

A variação na concentração da piperilina, no decorrer do ano, deve estar relacionada ao estresse hídrico, uma vez que a água é essencial para as funções fisiológicas da planta, sendo o recurso mais abundante para o crescimento e funcionamento dos vegetais (PIMENTA, 2008). Assim, fatores fisiológicos críticos, tais como fotossíntese, abertura e fechamento dos estômatos, mobilização de reservas, expansão foliar e crescimento, podem ser alterados pelo estresse hídrico e consequentemente pode levar a variações no metabolismo secundário (GOBBO- NETO e LOPES, 2007).

Variações temporais e espaciais no conteúdo total, bem como as proporções relativas de metabólitos secundários em plantas ocorrem em diferentes níveis (sazonais e diárias; intraplanta, inter e intraespecífica) e, apesar da existência de um controle genético, a expressão pode sofrer modificações resultantes da interação de processos bioquímicos, fisiológicos, ecológicos e evolutivos (LINDROTH et al., 1987; HARTMANN, 1996).

A análise do ritmo sazonal (Figura 37-A, p. 103) mostra um aumento significativo na concentração da piperilina nos meses de janeiro, março, junho, novembro e dezembro, enquanto o ritmo circadiano mostra um maior acúmulo da amida nos horários de 11 h e 23 h (Figura 37-B, p. 103). Estes horários estão perfeitamente acoplados aos turnos de visitação dos polinizadores e dispersores de espécies vegetais, dentre estes a avifauna (CAMPOS et al., 2012; MACHADO e ROCCA, 2010) que tem o hábito diurno de visitação na grande maioria das espécies, e a quiropterofauna (CAMPOS et al., 2012; CARVALHO e TAVOLONI, 2007) que tem o hábito noturno de visitação. Um dos fatores importantes, no estudo da sazonalidade, é a época de coleta das partes organográficas envolvidas, uma vez que a quantidade e, até mesmo, a natureza dos constituintes ativos sofrem uma grande variabilidade durante o ano (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).

Neste sentido, quase todas as classes de metabólitos secundários sofrem alterações no seu conteúdo, em função da variação sazonal, como exemplo, os alcaloides (ROBINSON, 1974; ELGORASHI, et al., 2002; WU, et al., 1996). Além disso, tem sido mostrado que estresses ambientais, tais como luz elevada, temperaturas frias, irradiação UV e infecção patogênica estimulam a produção de compostos fenólicos, tais como os flavonóides e fenilpropanóides em plantas (GRACE et al., 1998; BHARTI e KHURANA, 1997), por exemplo, a fenilalanina-amônia liase (PAL) que aumenta sua atividade em resposta ao estresse de refrigeração e/ou congelamento (LEIVA et al., 1995), ou sinais oxidativos intracelulares em resposta ao ataque de patógenos e, possivelmente, outras formas de estresses (LEVINE et al., 1994).

A análise dos dados circadiano e sazonal em P. arboreum, permitiu inferir que os teores da piperilina estão relacionados à variação da precipitação, ou seja, ao conteúdo hídrico da planta, e que os metabólitos são acumulados nos períodos mais frescos do dia (Figura 38, p. 103). As concentrações para quantificação da piperilina estão listadas nas Tabelas 10 e 11, respectivamente.

Tabela 11: Dados da quantificação da análise sazonal da piperilina (1).

MÊS COLETA [ ] mg/mL _%m/m Jan 0,0956 9,56 Fev 0,054 5,40 Mar 0,0855 8,55 Abr 0,0456 4,46 Mai 0,0358 3,58 Jun 0,0660 6,60 Juh 0,0234 2,34 Ago 0,0155 1,55 Set 0,0310 3,10 Out 0,0499 4.99 Nov 0,0669 6,69 Dez 0,0794 7,74

Tabela 12: Dados da quantificação da análise circadiana da piperilina (1).