A realização de traqueostomia pode ocasionar complicações pós- procedimento em até 65% dos casos, que podem ser desencadeadas pelo período em que o paciente foi submetido à intubação, tempo de traqueostomia, entre outras condições clínicas(6). Dentre as complicações, o tecido de granulação pode levar à oclusão ou resultar na estenose. A traqueomalácia, fístula traqueoesofágica, dentre outras são consideradas clinicamente importantes, porém com menor frequência, sendo também associadas à taxas consideráveis de morbidade e mortalidade.
Heffener et al. 1986 (86) relataram que estes pacientes apresentam outras condições médicas graves (incluindo falência de múltiplos órgãos) e que em alguns casos estas complicações traqueais podem não ser diagnosticadas precocemente. Além disso, sob condições de choque, pode haver o comprometimento maior do fluxo sanguíneo, ocasionando isquemia mucosa das vias aéreas.
As complicações podem estar relacionadas ao balonete do tubo de traqueostomia (cuff) inflado, especialmente quando atinge a parede traqueal posterior. Quando a lesão na via aérea ocorre, desencadeia uma série de fatores sinalizadores químicos, que podem levar ao refluxo laringofaríngeio e agravar a condição, por aumentar a extensão da lesão. A associação de secreções inflamatórias pode prejudicar ainda mais a lesão.
Para o tratamento das complicações, uma série de abordagens terapêuticas pode ser aplicada. Dependendo do grau de obstrução, o tratamento pode ser mais invasivo. No entanto, algumas destas opções ainda não foram submetidas a ensaios controlados randomizados.
No caso da estenose, a broncoscopia é o tratamento de escolha. A ressecção a laser pode ser um alternativa, embora possa haver reincidência na formação do tecido de granulação, segundo descrito por Mehta et al. 1993(87). Entretanto, há situações clínicas em que a ressecção a laser não é indicada,
sendo o ideal para estas condições a colocação de stent ou ressecção cirúrgica. Ainda assim, a realização da cirurgia é dependente da condição do paciente, do tamanho da lesão e sua complexidade. Frequentemente, a utilização de stents leva ao surgimento de infecções e o paciente é submetido à novas cirurgias, para troca do dispositivo.
No caso da traqueomalácia, as alternativas de tratamentos também não são efetivas e podem envolver a colocação de stents, ressecção traqueal e traqueoplastia. A escolha destas opções varia de acordo com a gravidade da obstrução traqueal, conforme descrito por Feist et al. 1975(88).
A escolha da conduta terapêutica para tratamento das fístulas traqueoesofágicas também pode variar de acordo com a condição clínica do paciente. A análise dos dados acima salientou a baixa qualidade de vida desses pacientes submetidos aos tratamentos atuais para estas complicações e também que, frequentemente, quando são acometidos por processos infecciosos em decorrência à colocação de stent, esses pacientes são submetidos à nova cirurgia, para troca do dispositivo, demandando alto custo hospitalar. O intuito deste projeto foi avaliar se a utilização de biomaterial submetido à cultura de células- tronco mesenquimais estromais na forma de biocurativo, poderia produzir uma melhor regeneração tecidual.
Em outros trabalhos do nosso grupo, Volpe et al. 2014(75), a caracterização das MSCs- TA foi realizada por meio: da capacidade das células obtidas de tecido adiposo de se aderirem ao plástico, imunofenotipagem por citometria de fluxo; diferenciação mesodérmica in vitro para linhagens adipogênica, condrogênica e osteogênica, análise citoquímica das MSCs- TA diferenciadas; imunocitoquímica e microscopia confocal,seguindo as orientações da “Mesenchymal and Tissue Stem Cell
Commitee of the International Society for Cellular Therapy”(ISCT).
Os resultados obtidos demonstraram que as células tiveram capacidade de aderir ao plástico. A análise por citometria de fluxo apresentou resultados positivos para os marcadores como CD105 (endoglina), CD73 (5'-nucleotidase) e CD90 (Thy-1), e negativos para CD45, CD34, CD14, CD11b,CD79a, CD19 e
HLA-DR, conforme as determinações do ISCT. Este estudo é rotineiramente conduzido para avaliar a pureza da população de células mesenquimais, como citado por Wagner et al. 2005(23). Além disso, as células tiveram a capacidade de se diferenciar para as linhagens mesodérmicas, conforme demonstrado por Vizoso et al. 2017, Yosupov et al. 2017, McIntyre et al. 2016, Pérez- Silos et al. 2016, Kocan et al. 2017 e Darzi et al. 2016 (25,89–93).
As MSCs- TA passaram também por uma análise para verificar o potencial neoplásico destas células. Segundo descrito por Borgonovo et al. 2014(94), as células- tronco têm um grande potencial para utilização em várias áreas de terapia celular e para garantir o número de células a ser utilizado para esta finalidade, estas células são submetidas à muitas expansões; No entanto, o aumento da instabilidade genética pode estar diretamente relacionado com o tempo de cultivo celular. Desta forma, um controle rigoroso de qualidade e segurança é necessário para que a expansão in vitro dessas células possa ser conduzida sem acarretar em alterações genéticas e epigenéticas, devido à instabilidade gênica.
A avaliação do potencial neoplásico pode ser realizado pela análise da atividade da enzima telomerase e também por estudos citogenéticos, especialmente cariotipagem, visto que a manutenção do cariótipo normal é um indicador confiável da estabilidade genética das MSCs, que permite a identificação de anormalidades estruturais nos cromossomos(94–96).
A enzima telomerase é uma transcriptase reversa que participa ativamente do processo de divisão celular em eucariotas. Garbe et al. 1999 (96) e colaboradores descrevem que a atividade da enzima telomerase está presente em células tumorais e células com alto potencial de auto-geração, porém em células tumorais a atividade desta enzima estaria associada à telômeros mais curtos. A atividade desta enzima diminui com o passar do tempo em que as células vão atingindo um estágio mais maduro, como descrito previamente por Volpe et al. 2014 (75) e Manzini et al. 2015 (74).
Os resultados encontrados para a análise da estabilidade gênica em nosso estudo corroboram os encontrados por Borgonovo et al. 2015 (97),
viabilizando a utilização destas células para terapia celular e engenharia de tecidos.
Este trabalho utiliza estruturas produzidas a partir de PLLA submetido ao processo de eletrofiação para suportar a adesão e proliferação celulares, uma vez que os biopolímeros sintéticos possuem algumas vantagens. Conforme descrito por Ahmadi et al. 2017 (98), os polímeros biodegradáveis podem ser submetidos a diferentes processos de biofabricação, incluindo à eletrofiação. Fazili et al. 2016 (99) descreve a utilização de scaffolds de PLLA eletrofiado para cultivo de células- tronco mesenquimais estromais.
Neste estudo, as fibras foram caracterizadas analisando a sua morfologia por meio da microscopia eletrônica de varredura (MEV). Além disso, foi realizada a caracterização por Differential Scanning Calorimetry (DSC).
Conforme as imagens de MEV evidenciam, as mantas apresentaram fibras aleatórias com diâmetro homogêneo ao longo do comprimento da fibra. Além disso, as fibras apresentaram poros, facilitando a adesão e proliferação celulares, corroborando os resultados apresentados por Fazili et al. 2016 (99) e Tan et al. 2015 (100), as fibras produzidas neste trabalho seguiram um padrão de tamanho e diâmetro (101,102).
A caracterização das fibras de PLLA produzidas também foi realizada por DSC. Conforme descrito por Gill et al. 2010 (103), frequentemente, calorímetros são usados em química, bioquímica, biologia celular, biotecnologia, farmacologia e em nanociências, a fim de avaliar as propriedades termodinâmicas dos mais diversos materiais. Entre os diversos tipos de calorímetro, o DSC é o mais popular. No presente estudo, a análise do PLLA eletrofiado foi comparada à amostra de PLLA prévia ao processo de eletrofiação. Assim como Righetti et al. 2017(79), a taxa de aquecimento aplicada neste estudo foi de 10 °C/min. Os resultados encontrados não demonstraram diferenças significativas entre os valores encontrados das temperaturas de fusão do PLLA pré- e pós- eletrofiação. A temperatura de fusão (Tm) é de cerca de 178 ° C para PLLA, que está de acordo com os
resultados encontrados na literatura (84,85). O fato de não terem sido encontradas diferenças significativas entre as temperaturas pode sugerir também que não há resquícios dos solventes (clorofórmio e acetona) utilizados para preparo das amostras de PLLA submetidas ao processo de eletrofiação, que poderia ser tóxico para as células, inviabilizando os experimentos in vitro e
in vivo. Além disso, após o segundo aquecimento, a amostra eletrofiada
apresentou aumento considerável no grau de cristalinidade, o que seria associado à orientação molecular que poderia ocorrer devido ao campo elétrico alto (104). A redução da Tg é comum após o processo de eletrofiação e é motivo de debate, podendo estar associado principalmente a alguns fatores, como a alta área superficial, a alta orientação molecular das cadeias poliméricas (104,105). Ademais, a temperatura de cristalização a frio (Tc) das fibras eletrofiadas diminuiu para o segundo aquecimento. De acordo com Inai
et al (106), a cristalização a frio durante o aquecimento DSC é induzida pela
orientação molecular das fibras eletrofiadas. Assim, o Tc é menor para fibras eletrofiadas em comparação com a matéria-prima (106).
Apesar de não ser encontrada na literatura uma avaliação de biocompatibilidade entre as células- tronco mesenquimais estromais e biomaterial derivado de PLLA, neste estudo realizamos ensaios que avaliaram a viabilidade, adesão e citotoxicidade (103,107).
A análise de adesão celular foi realizada por MEV. No presente estudo, corroborando os resultados encontrados por Fazili et al. 2016(99),as fibras alongadas permitiram a adesão celular e induziram a aderência ao longo do comprimento das fibras. Além disso, como demonstrado por Tan et al. 2015(100) e Schaub et al. 2015(77), as células cultivadas in vitro nos scaffolds expandiram no microambiente, formando um tapete celular tanto na superfície do material quanto no seu interior, devido à presença de poros formados pelas fibras que facilitaram a adesão de células no interior da estrutura.
A viabilidade destas células cultivadas no “scaffold “de PLLA eletrofiado foi avaliada por imunofluorescência (técnica do LIVE/DEAD®). Diversos estudos relatam a viabilidade das MSCs em diferentes tipos de scaffolds
poliméricos. Ricles et al. 2011(108) avaliou a viabilidade de MSCs quando cultivadas em scaffolds de polietileno glicol após 1, 4 e 7 dias de cultivo. Assim como os resultados encontrados neste estudo com scaffolds de PLLA, as imagens mostram que as células permaneceram viáveis ao longo do período em que foram cultivadas. As fotos também mostram que houve presença mínima de morte celular.
O efeito tóxico das fibras de PLLA nas MSCs-TA foi analisado por MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5-difenil-2H-tetrazólio). Gerlier e Thomasset et al. 1986(109) relatam que a redução do MTT para o formazan pode ser realizada para diversos tipos celulares. Isto sugere que o ensaio colorimétrico MTT pode ter aplicabilidade muito ampla para medir a sobrevivência e / ou a proliferação de várias células, no entanto a sensibilidade para o MTT varia de acordo com o tipo celular(110).No presente estudo, as células foram capazes de se proliferar no biomaterial, expressando uma taxa de proliferação mais significativa após o sétimo dia de cultivo, assemelhando- se aos resultados encontrados por Mashhadikhan et al. 2015 (111). O estudo conduzido por Mashhadikhan analisou a citocompatibilidade de células- tronco mesenquimais estromais em estruturas híbridas produzidas com PLLA e policaprolactona (PCL) diariamente por até 5 dias e observou que as células se proliferaram no material e mantiveram-se viáveis.
Os resultados que foram obtidos na avaliação da biocompatibilidade entre o biomaterial e as células encorajaram a realização das análises in vivo, em modelo suíno, para aplicação em medicina regenerativa na área de cirurgia torácica.
O presente estudo foi conduzido com animais de grande porte, o que permite uma melhor adequação com a escala anatômica, visto que a anatomia traqueal tem uma semelhança significativa com a traqueia humana, permitindo a realização da lesão de tamanho significativo para ser considerado de valor clínico. Corroborando esta prática, outros estudos na área de cirurgia torácica descrevem a utilização de animais de grande porte para condução de experimentos in vivo. Machuca et al. 2017 (112)que conduziram um estudo de
terapia gênica em modelo experimental submetido à transplante de pulmão. Os animais escolhidos pelo grupo foram porcos Yorkshire. Rehmani et al. 2017 (113) também utilizaram desta mesma linhagem para conduzir um estudo na área de engenharia de tecidos, a fim de produzir uma traqueia artificial produzida de PCL e matriz extracelular decelularizada para reparo de lesão anterior na traqueia. A raça de porcos da linhagem Large- White, utilizada neste presente estudo é originária do cruzamento entre a linhagem Yorkshire e
Leicestershire, resultando em animais de mesmo porte e pelagem.
A fim de restabelecer as funções normais dos tecidos lesionados, a medicina regenerativa objetiva, além de restaurar o tecido danificado, acelerar o processo regenerativo tissular. Para acelerar este processo, um dos grupos de animais submetidos à ressecção traqueal neste estudo recebeu células- tronco mesenquimais estromais aderidas ao fio de sutura.
A aplicação de fios de sutura com MSCs-TA aderidas em cirurgia torácica é uma possibilidade sugerida por Volpe et al. 2014 (75) que obteve resultados que sustentam a possibilidade de uso desta alternativa em possíveis tratamentos de diversas áreas. Ele descreve a utilização dos filamentos de sutura com células- tronco mesenquimais estromais aderidas, utilizando uma cola de fibrina, especialmente desenvolvida e padronizada para otimizar a aderência celular à estrutura, sendo que esta cola de fibrina não interfere na sobrevida e viabilidade das células. Volpe ainda ressalta que as células continuam secretando os fatores de crescimento, reforçando os resultados de que a cola de fibrina não afeta a viabilidade celular.
Para melhor entendimento da maneira como se desenvolveu o processo regenerativo tissular nos diversos grupos, foram realizadas as análises histopatológicas, com coloração HE, que segundo descrito por Zarella et al. 2017(114), é uma das principais marcações utilizadas em histopatologia e mais utilizadas no diagnóstico médico.
Podemos comparar os resultados histopatológicos dos grupos controle negativo e o Sham com os grupos que receberam biocurativo.
No grupo Sham, a análise histopatológica demonstrou que a presença significativa de infiltrados inflamatórios, com muitos linfócitos presentes na região lesionada. Foi observado também que o tecido não apresentava a organização do tecido traqueal normal, comparado ao grupo controle negativo que não foi submetido à ressecção traqueal. No grupo controle, é possível observar o epitélio ciliado pseudoestratificado ao lúmen traqueal com células caliciformes, glândulas seromucosas e musculatura lisa. As fibras de colágeno são alinhadas.
Ficou evidente que houve uma melhor regeneração nos grupos que receberam células, especialmente o grupo 4, que recebeu implante de biocurativo e fio de sutura com MSCs- TA aderidas quando comparado com o grupo Sham (grupo 02). Neste grupo houve uma remodelação do tecido, as fibras de colágeno encontram-se mais alinhadas, quando comparadas ao grupo 03. Também foi possível observar que o epitélio ciliado pseudoestratificado foi regenerado, assim como as glândulas seromucosas apresentavam padrão arquitetônico, com ausência de processos inflamatórios, evidenciando assim uma melhor recuperação histológica.
No grupo 3, que recebeu biocurativo e fio de sutura sem células, as imagens apresentam ainda um desarranjo da arquitetura das glândulas e das fibras de colágeno. No entanto, também não houve processo inflamatório. É possível observar que o epitélio ciliado pseudoestratificado foi regenerado.
As MMPs são endopeptidases dependentes de zinco e de cálcio, com atuação na degradação e remodelação da matriz extracelular (ECM) nos tecidos, especificamente em diferentes segmentos de ECM como colágeno, gelatina e elastina. As MMP-2 e MMP-9 são gelatinases envolvidas nos processos de angiogênese e neurogênese, decompondo moléculas da lâmina basal. (115,116) No grupo controle G1, foi possível observar uma imunomarcação fraca para ambas proteínas MMP-2 e MMP-9, ou seja, em condições normais, a expressão destas enzimas é restrita, evitando a degradação desmedida da matriz extracelular. (117)
O grupo 2 apresentou imunorreação significativamente intensa para estes marcadores quando comparada ao outros grupos, demonstrando então uma grande atividade desta enzima no processo regenerativo inicial, a fim de remodelar o tecido e gradualmente esta atividade vai diminuindo no final do processo de regeneração do tecido. Este processo sinaliza a relação da atividade destas enzimas com o processo inflamatório envolvido no processo de regeneração do tecido lesado. Nos grupos que receberam o implante com células- tronco mesenquimais estromais cultivadas a imunorreatividade para este marcador foi menos expressiva que no grupo 2, mas ainda mais intensa que o G1, o que pode ser associado à ação moduladora das MSCs-TA.
No adulto, a angiogênese é essencial durante alguns processos, como no crescimento e reparo de tecidos, assim como é um decurso subjacente fundamental na patogênese de várias doenças, como câncer e inflamações crônicas. Desde a sua descoberta em 1983, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF ou fator de permeabilidade vascular, na sua isoforma principal VEGF-A) surgiu como o regulador mais importante da formação de vasos sanguíneos em condições normais e patológicas. (118)
Assim, como observado nos resultados encontrados para as MMPs, a imunomarcação para VEGF foi intensa no G2 quando comparada ao outros grupos. Esta expressão pode estar relacionada ao processo inflamatório na tentativa de remodelação do tecido danificado, em que pode haver uma reprogramação nas células endoteliais, levando ao aumento na produção de um grande número de diversas proteínas envolvidas e relacionadas a angiogênese, incluindo algumas proteases como as MMPs, (17,118,119). Nos grupos 3 e 4 a imunorreatividade foi menos expressiva que no grupo 2 para este marcador.
As células residentes estimulam a MEC adjacente permitindo a migração e a proliferação dos componentes celulares do estroma (fibroblastos, células estromais, entre outros). À medida que os fibroblastos imigram para o local da ferida, eles produzem colágeno tipo III e colágeno tipo I para proporcionar maior integridade estrutural à matriz (120).
Nos resultados encontrados no presente estudo, as imunorreatividades para os colágenos foram significativamente intensas nos grupos G1 e G4 em relação aos demais grupos experimentais. Este fato pode estar relacionado com a substituição gradual do colágeno tipo III é substituído por colágeno tipo I durante o processo de regeneração (fase de proliferação).
A IL-10 é uma potente citocina anti-inflamatória e imuno-reguladora, que também está envolvida em processos como o remodelamento e homeostase da matriz extracelular. Além disso, a IL-10 parece ter efeitos anti-apoptóticos, uma vez que inibir as atividades de caspase induzidas por TNF-α.
Em engenharia de tecidos, a utilização de scaffolds pode interferir na secreção destas proteínas inflamatórias. Conforme descrito por Silva et al. 2017 (121), fragmentos de quitina de diferentes tamanhos desempenham diferentes papéis nas respostas. Para este marcador, as imunomarcações foram significativamente intensas nos grupos G1 (controle negativo) e G4 (biocutativo e fio de sutura com MSCs-TA aderidas) em relação aos demais grupos, indicando a possível relação direta entre a quantidade implantada de MSCs-TA, presentes tanto no biocurativo quanto no fio de sutura, e sua ação imunomoduladora no sítio da lesão.
Os resultados encontrados pela quantificação das fibras colágenas por meio da coloração tricômo de masson corroboraram os achados neste trabalho por meio das análises de imunohistoquímica. O tricromo de masson permitiu corar em azul esverdeado o colágeno e em rosa avermelhado o citoplasma, demonstrando uma maior colagenização no grupo 4 (biocurativo e fio de sutura com MSCs-TA aderidas) semelhante ao grupo 1 (controle negativo), quando comparado aos demais grupos.
Com os resultados histopatológicos entendemos que após 30 dia, o processo regenerativo ocorreu de forma diferente nos grupos que receberam o biocurativo (grupo 03 e 04) quando comparados aos resultados obtidos no grupo Sham (grupo 02). Nesses grupos 03 e 04, houve uma regeneração mais eficiente, principalmente no grupo 04. Entende-se que as MSCs- TA
desempenharam um papel fundamental, imunomodulando a resposta imune, auxiliando o processo regenerativo como um todo.
Assim, os resultados encontrados nos experimentos pré- clinicos, onde foram utilizados biocurativos, produzidos a partir de PLLA eletrofiado com células- tronco mesenquimais estromais cultivadas, objeto de estudo deste trabalho, fazem crer numa nova possibilidade de tratamento para as complicações decorrentes da traqueostomia, descritas neste trabalho. Brevemente a cirurgia torácica poderá contar com o auxílio das células-tronco e com fios de sutura enriquecido com células- tronco aderidas, o que levaria a uma diminuição no número de internações hospitalares, de cirurgias reparadoras, aumentando a qualidade de vida do paciente.
Este trabalho visa poder traduzir esta tecnologia empregada nos experimentos in vivo para desenvolver um produto aplicável clinicamente, conforme descrito por Schwartz e Macomber et al. 2017(122). Eles relatam sobre medicina translacional, que se concentra no desenvolvimento e na validação de conceitos que abordam as necessidades do mercado por meio da tradução dos resultados encontrados na ciência básica para ensaios clínicos. O biocurativo teve a patente depositada (INPI, nº BR 10 2017 026857 8) e pode ser uma alternativa que muitos pacientes possam se beneficiar no futuro.
Além da possibilidade de translacionar esta pesquisa à prática clínica, há ainda muito a ser explorado na área de engenharia de tecidos quanto à multipotencialidade celular das MSCs-TA e a capacidade imunomodulatória destas células. A utilização de biomateriais derivados de PLLA também é uma