DISCUSSÃO

Um conjunto de perfis de transcriptomas de amostras de batatas foi usado para explorar as possibilidades de classificação por análise multivariada supervisionada como ferramenta para avaliação de segurança de alimentos para novas variedades. Um dos objetivos foi elucidar o modo como diferentes fontes de variação influenciariam na classificação. Como fontes de variação, foram incluídos: variedade de batata, local de cultivo, ano  de  colheita  e  replicata  biológica.  Uma  amostra  “extrema”  foi   incluída   como representante que se esperaria ser classificada fora do patamar na maioria dos casos, permitindo assim erros de classificação devido ao limite de confiança de 95%. Para maior clareza, esta amostra (S08-1158) foi considerada um outlier neste trabalho, apesar de não ter sido considerada

outlier no estudo original (VAN DIJK et al., 2012), já que esta amostra

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Conj. treinamento Conj. validação Conj. teste S08 Conj. teste Maris Piper Limite de 95% confiança B (3 comp) F (3 comp) I (3 comp) L (4 comp) S10 (3 comp) Dis tân cias de clas se B

ainda fazia parte do agrupamento no gráfico de PCA de acordo com os grupos de tratamento naquele estudo.

As análises A e B combinadas permitiram salientar a importância de incluir suficiente variação representativa para a construção de um classificador para evitar a presença de falsos-positivos. Na análise A, nove das 20 classificações individuais foram falso-positivas à luz da avaliação de segurança. Classificação fora da classe segura foi baseada nas diferenças combinadas de ano e local de colheita e variedade, e não em alguma amostra realmente insegura. Na análise B, distâncias de classe para amostras de teste e de treinamento ficaram mais próximas entre si e, em alguns casos, observou-se até sobreposição dos valores, exceto para a amostra outlier S08-1158. A razão para isso é que as amostras de treinamento utilizadas para construir esse classificador eram mais representativas para todas as amostras deste conjunto particular de dados.

Os conjuntos de dados então disponíveis não eram representativos da verdadeira população de variedades de batatas disponível no mercado. Consequentemente, esses resultados não são ainda suficientes para inferir probabilidades de falsos positivos e negativos. No entanto, é informativo sobre como as taxas de erro calculadas são dependentes da metodologia escolhida. Por exemplo, a variedade Maris Piper foi classificada como não estando dentro do patamar em três dos 10 classificadores, apesar de ser uma batata conhecidamente segura. Consequentemente, poderia se dizer que existiram três observações falso-positivas para este cultivar. Por outro lado, se uma classificação média por amostra fosse considerada, a maioria dos classificadores ajustaram ambas as amostras desta variedade como pertencente ao patamar, indicando dois verdadeiros negativos e nenhum falso positivo ou falso negativo. Especialmente para o perfil de amostra mais diferente neste trabalho, S08-2011, a classificação ficou fora do patamar para todos os classificadores na análise A e em quatro (de cinco) da análise B. Tal resultado levaria a maiores investigações dos dados em uma avaliação de segurança de alimentos. Ou seja, nesta configuração, a variedade Sante claramente não seria considerada como não pertencente à classe segura baseada somente nesta amostra, uma vez que as outras amostras Sante foram menos diferentes. Ao contrário, isso prova que uma amostra outlier vai ser identificada como tal. Transportando para uma situação real, isso significa que se: 1) todas as replicatas de uma nova variedade caíssem fora da classe segura e 2) as amostras na classe segura fossem representativas de uma variação normal, essa nova variedade exigiria de fato investigação mais aprofundada.

Este estudo mostra que, a princípio, perfis de transcriptoma podem ser usados para classificar tubérculos de batatas como pertencentes ou não

pertencentes a um grupo conhecido de batatas. Essa classificação pode formar a base para identificar potenciais perigos em novas variedades de batatas, por exemplo, no caso de efeitos não intencionais de técnicas de melhoramento, incluindo GM. Sobre esse aspecto, é importante notar que a identificação de perigo de novas variedades conforme apresentado aqui está no contexto do cumprimento dos requerimentos regulatórios mundiais. Quando esta abordagem for mais desenvolvida e validada, será provavelmente mais informativa e eficaz em termos de custos do que os testes de alimentação feitos em animais atualmente obrigatórios na União Europeia para identificar efeitos não intencionais em novas plantas.

Os classificadores apresentados aqui servem como prova de princípio. Para aplicações práticas e validação da classificação multivariada de uma classe, é preciso determinar o correto threshold para associação de classe segura. Na avaliação de segurança, falsos negativos são mais preocupantes do que os falsos positivos. Falsos negativos podem levar ao aumento do risco, enquanto falsos positivos apenas aumentarão desnecessariamente a necessidade de análises toxicológicas pós- classificação para os perfis classificados fora da classe segura. Um estudo bem definido, contendo amostras não seguras conhecidas no conjunto de teste, assim como maior quantidade de amostras seguras conhecidas, auxiliará na determinação deste valor threshold e na metodologia proposta como um todo. Essa abordagem com o classificador ainda é basicamente a mesma que a atualmente utilizada (análise-alvo) para análise composicional de novas variedades de plantas. No entanto, a utilização de perfis provenientes de análises ômicas aumentará significativamente o conteúdo de informação subjacente à identificação de perigos.

O presente estudo propõe uma expansão da atual análise-alvo para uma abordagem não-alvo composicional comparativa, baseada em perfis ômicos, para identificação de perigos na avaliação de segurança de alimentos. Propõe, ainda, a aplicação de classificação multivariada de uma classe para identificação de perigo, dependendo se os perfis de novas variedades de plantas caírem dentro ou fora de uma classe de perfis geralmente reconhecidos como seguros. A correspondência entre os resultados esperados e os observados do conjunto de classificadores deste trabalho abre as portas para desenvolvimento de mais estudos e validação desta abordagem.

CAPÍTULO 3

ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS COM DADOS DE PROTEÔMICA DE BATATAS VISANDO AVALIAÇÃO

COMPLEMENTAR DE ALIMENTOS

Artigo submetido para publicação:

MELLO, C. S., VAN DIJK, J.P., VOORHUIJZEN, KOK, E. J., ARISI, A. C. M. Principal component analysis of potato proteomic data aiming complementary food assessment. New Biotechnology (2013).