Neste estudo, foram avaliadas as expressões diferenciais dos genes BBM2,
LEC1 e WOX4, fornecendo informações sobre o padrão de expressão durante o
desenvolvimento da ES, tanto na via direta quanto na indireta. Paralelamente, tentou-se identificar as cópias homeólogas no genoma de C. arabica. A homeologia pode ser estudada para o gene Baby Boom (BBM2). Durante a embriogênese somática indireta, o homeólogo derivado do subgenoma CaCe foi predominante expresso no calo. Essa diferença na expressão pode ter ocorrido em resposta a estresse sofrido durante a ESI, visto que as células passam pelo processo de indiferenciação, dando origem ao calo. Sabe-se que os genes homeólogos podem apresentar padrões de expressão desigual, em resposta a diferentes tipos de estresse (Grover et al. 2012; Liu and Adams 2007). As diferenças na expressão gênica podem também ser resultantes de mudanças na regulação cis e/ou trans, que pode afetar a transcrição e a estabilidade do mRNA ou resultar na divergência funcional de fatores de transcrição (Shi et al. 2012; Wittkopp et al. 2004).
O perfil de expressão do gene BBM2, na ESD, apresenta uma expressão aumentada com 28 dias de cultivo in vitro, quando o explante já apresenta uma massa pró-embriogênica desenvolvida com presença de células meristemáticas (dados apresentados no primeiro capítulo), indicando que o gene pode estar envolvido na formação das regiões meristemáticas. O mesmo foi observado em C. canephora, onde a expressão diferencial deste gene foi observada somente após o desenvolvimento da massa pró-embriogênica, indicando que o BBM induz vias relacionadas com a proliferação e crescimento celular (Nic-Can et al. 2013). Boutilier et al. (2002) propôs que o gene BBM está envolvido na conversão do estado vegetativo para o estado embriogênico, demonstrando em Brassica napus que o gene atua na diferenciação das células embrionárias a partir de células somáticas. O gene também apresentou uma expressão relativa aumentada, nos estádios embrionários: globular e torpedo. Durante o desenvolvimento do embrião, a maior expressão foi observada na fase globular, o mesmo foi descrito para Arabidopsis thaliana (Kulinska-Lukaszek et al. 2012). Os dados obtidos no trabalho corroboram com o descrito na literatura, em que BBM parece desempenhar um papel importante na formação e diferenciação do embrião durante a ES (El Ouakfaoui et al. 2010; Florez et al. 2015; Galinha et al. 2007; Passarinho et al. 2008).
Durante a ESI, a expressão diferencial do BBM2 ocorreu com 60 dias de cultura in vitro, este pico na expressão pode ser explicado pela presença da auxina, ácido naftaleno acético (ANA), no meio de indução de embriões, para o qual os calos foram transferidos após 50 dias de cultura. Li et al. (2014) e Kulinska-Lukaszek et al. (2012) comprovaram que a atividade aumentada do gene BBM pode estar relacionada à presença de auxina no meio de cultura. Isto se deve ao fato de que o gene BBM2 apresenta um domínio AP2. Vários genes contendo esse domínio são altamente induzidos na presença do hormônio ANA (Imin et al. 2007).
Analisando a expressão relativa do gene LEC1, observou-se que ele apresenta um perfil de expressão parecido com o relatado para o gene BBM, inferindo que possa haver funções complementares entre os genes (Gaj et al. 2005). Ambos participam da aquisição da competência embriogênica nas células (Boutilier et al. 2002; Gaj et al. 2005). LEC1 é um regulador positivo nas fases precoces e tardias da embriogênese e sua expressão é necessária para induzir ES (Lotan et al. 1998), enquanto BBM é essencial para a proliferação celular e morfogênese durante a embriogênese (Passarinho et al. 2008). Durante a ESD, o gene LEC1 apresenta maior expressão nos estádio 28 dias e no embrião globular, demonstrando sua função na aquisição de competência embriogênica da célula e na formação do embrião.
Durante a ESI, os níveis de expressão de LEC1 foram baixos, apresentando um aumento discreto com 28 e 60 dias de cultura in vitro. Estudos com calos de Vitis
vinífera, verificaram que o gene LEC1 é expresso durante a ES, antes do aparecimento
visível do embrião, comprovando seu envolvimento durante os processos de cultivo in
vitro (Schellenbaum et al. 2008). Mutantes nulos de Arabidopsis apresentaram uma
capacidade limitada de induzir a formação de embriões a partir de calos, sugerindo que o gene LEC por ativar genes essenciais para a iniciação da ES (Gaj et al. 2005), inferindo assim que este gene está envolvido na aquisição de competência embriogênica.
A correlação entre as expressões dos genes LEC1 e BBM pode ser explicada em parte, pela presença da marca epigenética H3K27me3 em ambos os genes, que em condições embriogênicas, atua na reprogramação epigenética, através de metilação do DNA e modificação das histonas nas células somáticas, para promover a embriogênese somática e o desenvolvimento de embriões em café (Nic-Can et al. 2013).
O perfil de expressão do gene WOX4, em ambas as vias da ES, apresentou um discreto aumento da expressão relativa a partir do início da divisão celular, ou seja, 28 dias na ESD e a partir de 8 dias na ESI. Genes da família WOX cumprem funções especializadas em processos chaves de desenvolvimento em plantas, como a padronização embrionária, manutenção de células-tronco e formação de órgãos (van der Graaff et al. 2009). Estas funções podem estar relacionadas com a promoção da divisão e diferenciação de celular em plantas (Aichinger et al. 2012; Hirakawa et al. 2008; van der Graaff et al. 2009).
Poucos estudos relatam a atividade e função do gene WOX4 durante a ES. Etchells et al. (2013) demonstrou que o gene WOX4 deve agir de forma redundante com outros fatores de transcrição da família WOX que desempenham um papel importante na coordenação da transcrição e estão envolvidos nas fases iniciais da embriogênese, na ativação dos meristemas caulinar e radicular e, na organogênese em plantas (Haecker et al. 2004). Estudos indicam que alguns genes da superfamília WOX podem ser reguladores importantes da ES, reduzindo a característica recalcitrante em cultivares de V. vinífera (videira) (Gambino et al. 2010).
Neste presente trabalho foram apresentados os padrões de expressão dos genes BBM2, LEC1 e WOX4 que, durante a ESD, tiveram um pico de expressão com 28 dias de cultura in vitro, tempo este que culmina com o início da formação da massa pró-embriogênica e com a presença de células meristemáticas. Já na ESI, os três genes apresentaram um perfil de expressão parecido com o descrito na literatura, ou seja, os genes BBM2 e LEC1 tiveram um aumento da expressão no calo e nos períodos próximos ao surgimento do embrião. Já o gene WOX4 apresentou uma expressão aumentada no início da indiferenciação do explante.
Considerando que na maioria dos estudos apresentados até o momento, os genes foram avaliados apenas na ESI, pouco se sabe ainda, sobre o padrão de expressão destes genes durante a ESD. Assim, foi possível comprovar que para Coffea
arabica os três genes estudados, podem desempenhar um papel na promoção da
proliferação celular e morfogênese durante a ESD e a ESI, sendo um provável regular do desenvolvimento do embrião na ESD.