Biocompatibilidade do compósito de poliéster e fibra de vidro
A escolha do compósito de resina de poliéster e fibra de vidro ocorreu devido a não se encontrar um polímero único que fosse biocompatível e que suportasse as cargas mecânicas impostas ao fêmur de bovinos. Tanto na medicina humana, como na veterinária vem crescendo, cada vez mais pesquisas, destinadas a materiais alternativos, que possuam melhores propriedades biológicas, do que implantes metálicos (Guillot et al., 2016). Compostos reforçados com fibra de vidro vêm sendo amplamente empregados, tanto na ortopedia, como na odontologia e vêm demonstrando vantagens como, alta resistência à tração, maleabilidade, alta resistência a impacto e também boa aparência estética. Mais além, implantes não metálicos podem produzir menos artefatos em imagens de tomografia computadorizada e ressonância magnética (Moritz et al., 2014). Os compostos reforçados com fibra de vidro possuem um módulo de elasticidade entre 15 a 20 gigapascal, faixa muito semelhante aos ossos cortical e esponjoso (Ballo et al., 2007; Moritz et al., 2014).
Essa condição de maleabilidade permite que os compostos reforçados com fibra de vidro contribuam diretamente na redução do efeito de “Stress shielding” pelo implante, desta forma as tensões geradas sobre o osso são distribuídas de uma forma mais homogênea, diferindo do que ocorre com implantes de titânio (Shinya et al., 2011). Dentre suas deficiências, os compósitos reforçados com fibra de vidro, com o tempo podem perder a sua resistência devido à sorção de água e a lixiviação de monômeros residuais ou produtos de hidrólise no espaço peri-implantar (Moritz et al., 2014).
53 A utilização do poliacetal como material implantado no grupo controle se justifica por ser material comprovadamente biocompatível e, principalmente, por ter sido utilizado previamente em forma de haste intramedular bloqueada em bezerros jovens. Nos animais em que esse material foi implantado não foram observados sinais de incompatibilidade tecidual (Spadeto, 2009).
Em relação aos achados mascroscópicos nos grupos experimental e controle, foi encontrada a formação de uma cápsula fibrosa circundado ambos os fragmentos. Este mesmo achado está em acordo com estudos anteriores, onde foram avaliados compostos de fios de fibra de vidro impregnados com resina bisfenol A metacrilato de glicidilo (BisGMA) / dimetacrilato de trietilenoglicol (TEGDMA), quando também é descrita cápsula fibrosa consistente em torno da circunferência de todo o implante (Ballo et al., 2011; Ballo et al., 2014).
Já os achados microscópicos evidenciam a presença de um tecido neoformado ao redor do implante constituído principalmente por células mononucleares e vasos neoformados, sendo este um achado comum a muitos dispositivos médicos implantados em subcutâneo de animais experimentais (França, 2005). Assim como observado por Davini et al. (2008), após 30 dias do implante os achados histopatológicos eram compatíveis com a fase de reparo e reorganização tecidual, evidenciando, além da pouca resposta inflamatória, a presença de cápsula fibrosa. Particularmente em dispositivos contendo vidro como um dos componentes, após 30 dias de implante subcutâneo. notam-se neovascularização e encapsulamento como principais achados, reforçando a irritação tecidual leve causada por estes dispositivos (Menezes-Silva et al., 2017). Segundo Davini et al. (2008) esta capsula fibrosa está associada a resposta natural do organismo. Apesar de ambos os matérias terem sido classificados irritantes leves, entende-se que houve biocompatibilidade, como a relação entre um material e o organismo, uma vez que ambos não produzam efeitos indesejáveis ao organismo (Silveira et al., 2004). No entanto quando um dispositivo sólido implantado, demonstra evidencias de incompatibilidade tecidual, a manifestação pode ocorrer de diversas formas, onde a resposta microscópica mais óbvia, é a presença de tecido morto ou morrendo, e este tipo de resposta aumenta de acordo com a exposição (Wilson et al., 1981).
Técnica cirúrgica para indução da fratura e osteossíntese.
A técnica de abordagem lateral do fêmur descrita por Milne e Turner (1974) e utilizada por Spadeto (2009) demonstrou ser de fácil execução, permitindo um bom acesso da diáfise femoral para indução da fratura e aplicação retrograda da haste intramedular. No entanto, a utilização desta técnica não permitiu progredir com a incisão nos sentidos proximal e distal do fêmur, devido à origem e à inserção dos músculos bíceps femoral, gastrocnêmio e vasto lateral. Dessa forma, houve limitação no distanciamento dos parafusos em relação ao foco da fratura.
Segundo Paolucci et al. (2018), no estudo prévio de elementos finitos utilizando três tipos de condições de bloqueios nas hastes, o posicionamento de parafusos de bloqueio nas extremidades da diáfise, em posição mais distante do foco da fratura, proporciona melhor distribuição de cargas na interface entre osso e implante e reduz o risco de falha. Apesar dessa limitação não ter sido considera totalmente determinante, uma vez que houve consolidação da fratura em cinco dos seis bezerros inicias, sua ocorrência foi relevante, pois as quebras nas hastes ocorreram sempre na interface com os parafusos.
54 Em experimento prévio utilizando haste de poliacetal no mesmo modelo de fratura em bezerros, ocorreram seis casos de fratura no pós-operatório imediato, sendo todas elas na interface haste e parafuso (Spadeto, 2009).
A fragilização da haste polimérica ocasionada pela inserção de parafusos também já havia sido relatada em um estudo ex vivo, em um modelo de fratura diafisária de fêmur em máquina universal de ensaios nos testes de flexão (Spadeto et al., 2008).
Segundo Seyhan et al. (2013), é necessário que as perfurações sejam realizadas em uma distância entre um e três centímetros do foco da fratura, devido ao risco de propagação da fratura, sendo que esse distanciamento pode diferir de acordo com o tipo e a qualidade do osso. No presente estudo, foi possível deixar os parafusos a cerca de um centímetro do foco da fratura e não foram observados casos de fragilização óssea durante a execução da técnica.
Referente ao procedimento de perfuração da haste durante o procedimento cirúrgico, esse foi um desafio pois, mesmo que o posicionamento da broca fosse no meio exato da diáfise óssea, a perfuração poderia não coincidir com o centro da haste. Isso, porque o canal medular possui um alargamento fora da área central, o que permitia que a haste se movimentasse nesta região. Essa mesma observação foi feita por Marval (2006), estudando hastes poliméricas intramedulares no úmero de bovinos jovens. Em humanos essa mesma limitação foi observada nos casos de fraturas distais de fêmur, onde é empregado o uso da haste intramedular bloqueada, sendo que a medula nesta porção é mais ampla, fazendo com que não ocorra o preenchimento completo do canal medular com a haste (Ricci et al., 2001; Stedtfel el al., 2004).
No sentido de reduzir esta dificuldade, o desenvolvimento de um gabarito para realização das perfurações e fixação dos parafusos de bloqueio poderá ser de grande valia, sendo também sugerida por Marval (2006) e Spadeto (2009). Em seres humanos, além do emprego do gabarito, também é utilizado a fluoroscopia, embora durante todo o procedimento cirúrgico o paciente é exposto a radiação (Seyhan et al., 2013).
Durante a inserção retrógrada da haste no canal medular foi encontrado o mesmo inconveniente já descrito por Spadeto (2009), quando não foi possível aparar a sobra da haste rente ao orifício de saída na fossa trocântérica. Isso ocorre devido ao orifício se encontrar entre ostrocânteres maior e menor, não sendo possível alcançar com o fio serra o local ideal para apara. A presença da haste fora do canal medular favoreceu o desenvolvimento de seroma em três dos animais operados e perdurou até os 60 dias pós-operatório em dois dos animais. No entanto não foi identificado dificuldade na cicatrização da pele, sendo que todos os animais tiveram os pontos removidos com 15 dias e não foram observados quaisquer sinais de infecção ou algo semelhante.
Análise comportamental
Como descrito anteriormente, a análise comportamental foi uma medida de avaliação dos bem- estar dos bezerros nos momentos pré e pós-operatório. Segundo Broom (1986) o bem-estar pode ser definido com o estado físico e psicológico dos animais frente às adaptações ao ambiente, que pode ser avaliado por meio de fatores fisiológicos e comportamentais. Dentre as medidas de avaliação de bem-estar, destaca-se a dor e o desconforto (Fajt et al., 2011; Gleerup et al., 2015). Contudo, essa avaliação desses parâmetros em animais ainda é um desafio, devido à subjetividade de suas naturezas e à incapacidade dos animais em expressar verbalmente (Whay, 2005). A
55 observação do comportamento dos bezerros, foi então escolhida como método de avaliação de seu bem-estar.
Bovinos com dor podem apresentar alterações posturais, como o arqueamento da coluna vertebral, abaixamento da cabeça, vocalização, bruxismo e modificações no comportamento social (Chapinal et al., 2010; Leslie & Petersson- Wolfe, 2012). No presente estudo, com exceção da alteração postural pela dificuldade de apoio do membro operado, nenhuma dessas alterações foram dignas de nota. Contudo, percebeu-se que os animais passavam mais tempo deitados, corroborando com Oliveira et al, (2014), que afirmaram que bovinos com dor gastam mais tempo deitados com a cabeça próximo ou sobre o solo. Apesar da avaliação do tempo percentual em decúbito não apresentar diferença estatística, os bezerros que passavam em torno de 45% do tempo deitados, passaram para cerca de 65% do tempo no pós-operatório imediato e depois de 30 dias para em torno de 60%. Esse fato não parece ter sido afetado pela utilização de fármacos analgésicos nos dias subsequentes ao procedimento cirúrgico.
Em relação ao interesse pelo alimento, foi visto que, principalmente no pós-operatório imediato os animais apresentaram redução de apetite, fato comprovado pela alteração de postura no momento da oferta de alimento (Fig. 8). A redução de interesse pelo alimento e a redução de seu consumo tem sido consistentemente relatados em bovinos jovens submetidos a orquiectomia (Fischer et al., 2001; White et al., 2008; Oliveira et al, 2014,), inclusive em animais lactentes (Robertson & Molony, 1994). No presente estudo, o interesse pelo alimento retornou a partir da primeira quinzena. Apesar de que, na segunda quinzena houve dois casos de anaplasmose, o que desencadeou um quadro de anemia e febre. Nesse momento, esses bezerros reduziram o interesse pela oferta da ração. Entretanto, logo após a terapia com oxitetraciclina de longa ação (20 mg/Kg) dose única, eles restabeleceram o comportamento como os demais bezerros que não desenvolveram hemoparasitose.
Avaliação pós-operatória
Os exames radiográficos foram fundamentais para identificação de complicações associadas à osteossíntese e para o acompanhamento do processo de consolidação óssea. Um dos animais apresentou desalinhamento dos fragmentos ósseos. Essa mesma observação foi feita por Marval (2006), que utilizou o mesmo modelo de fratura, só que no úmero de bezerros. Sem dúvidas, o ângulo da linha da osteotomia, que foi oblíquo com aproximadamente 30 graus em relação ao eixo longitudinal, é um fator que contribui para a falta de alinhamento ao favorecer o deslizamento entre os fragmentos ósseos.
Além desta complicação, também foi identificado, através das imagens radiográficas, o desprendimento dos parafusos corticais, situados na porção distal da diáfise óssea em um dos animais operados. Uma possiblidade seria devido à cortical do fêmur de bezerros jovens, que possui pouca densidade óssea (Trostle et al., 1996; Marval, 2006; Rodrigues, 2008), fazendo com que não ocorresse uma boa ancoragem dos parafusos corticais neste caso.
Referente ao animal que teve a haste fraturada com 21 dias após a cirurgia, verificou-se que a falha ocorreu no seu terço médio, bem na interseção entre a haste e o foco da fratura. Nesse caso, não se observado qualquer tipo de associação com erro de técnica. Existem outros fatores que poderiam causar esta fragilidade. Uma seria falha durante a construção da haste. Outra seria a disposição unidirecional das fibras de vidro, que permitiria que qualquer ponto de fragilização, seja por perfurações ou mesmo falha na sua construção, permita que uma pequena rachadura se
56 propague por toda sua extensão, fazendo que ocorra um colapso estrutural da haste. Na construção de novos modelos desse compósito, há de se pensar neste fato.
Mesmo com a exclusão do bezerro em que houve a quebra da haste, e com algumas outras intercorrências, houve resolução das fraturas nos outros cinco bezerros. A confirmação da consolidação óssea foi confirmada pela observação do calo ósseo e a não visualização da linha da fratura. Tais critérios estão de acordo com a escala para união de fraturas de tíbia, utilizado por Kooistra et al. (2010), sendo composto de um a três, onde o escore um o calo ósseo encontra-se ausente e linha de fratura visível, escore dois o calo ósseo presente e linha de fratura visível e escore três onde o calo está presente e linha da fratura ausente. Este é um resultado significativo, visto que em tentativas anteriores de ostessíntese usando o mesmo modelo, as hastes intramedulares de poliacetal e poliamida foram consideradas insuficientes para promover consolidação óssea.
Dentre as desvantagens do uso da radiografia para o acompanhamento pós-operatório, relata-se a exposição à radiação ionizante (Wawrzyk et al., 2015) e a impossibilidade de se identificar a fase inicial da calcificação (Craig et al., 1999; Wawrzyk et al., 2015). Tais afirmações estão de acordo com os achados encontrados nas avaliações radiográficas dos 5 bezerros, quando só foi possível visualizar a formação do calo ósseo a partir do dia 30.
As avaliações ultrassonográficas foram consideradas como um recurso valioso no acompanhamento do processo de consolidação óssea, permitindo a identificação de complicações envolvidas no pós-operatório, como a formação de seroma. Além disso, foi possível mensurar a distância entre os fragmentos ósseos depois de 15 dias. Além da ultrassonografia permitir visualizar o foco da fratura, também propiciou identificar as alterações relacionadas ao ponto de saída da haste, situado na fossa inter trocantérica, sendo estes achados já descritos anteriormente por (Spadetto, 2009).
Dentre os achados ultrassonográficos, destaca-se a identificação da formação do calo fibroso no dia 15, que coincide diretamente com a fase da reparação óssea quando o hematoma formado no momento da fratura começa a ser substituído por tecido fibrovascular com fibras de colágeno (Mckibbin, 1978). Isso demonstrou vantagem da ultrassonografia em relação a utilização da radiologia para o acompanhamento do processo inicial de consolidação óssea dos bezerros operados. Tais achados corroboram com outros estudos (Maffulli &Thornton 1995; Moed et al., 1998), onde a radiografia não detectou o calo não ossificado, formado no início da cicatrização óssea, diferentemente da ultrassonografia que permitiu visualizar tais alterações.
Semelhante ao relatado em alguns de seus bezerros por Spadeto et al. (2010), o bezerro número cinco desenvolveu hiperextensão da articulação metatarsofalangeana. Segundo Câmara et al. (2014) e Mulon (2013), essa alteração está associada à imobilização do membro afetado e à distribuição desigual do peso sobre o membro contralateral, ocasionando a hiperextensão da articulação metacarpo ou metatarso falangeana devido ao afrouxamento dos tendões flexores digital superficial e profundo. Tal complicação está associada a casos em que o processo de cicatrização óssea é demorado e também quando as instalações em que são mantidos no pós- operatório sejam desconfortáveis. No presente caso, acredita-se que o bezerro a desenvolveu devido a seu peso e seu comportamento, pois era um animal com escore corporal elevado em relação aos demais bezerros e mantinha-se grande parte do dia em pé, o que contribui para sobrecarga do membro contralateral.
57 Em relação ao bezerro que apresentou coleção de líquido na extremidade livre da haste, não houve evidências de processo infecioso ou de reação de corpo estranho, uma vez que a cultura foi negativa e a ferida criada para drenagem cicatrizou de forma rápida e completa. Acredita-se que essa ocorrência foi relacionada ao fato deste animal ter sido submetido a uma segunda osteossíntese. Nesse procedimento verificou-se a presença de vários fragmentos da haste original entre o tecido muscular e o subcutâneo. Apesar do estudo de biocompatibilidade ter revelado baixo potencial de irritação pelo compósito, também verificou-se que pequenos fragmentos da fibra de vidro liberados durante a perfuração da haste por broca ou pela fratura podem ser irritantes mesmo para as mãos do cirurgião.
Exames bioquímicos e hematológicos
Raras alterações estatísticas ou de significado clínico foram encontradas nos exames hematológicos. Houve leve leucocitose, condizente com a resposta inflamatória ocasionada pelo procedimento cirúrgico. Segundo Jain (1993), a leucocitose está relacionada a processos inflamatórios agudos, onde os leucócitos circulantes são recrutados para realização de fagocitose tecidual. Além disso, o aumento nos níveis de neutrófilos segmentados (neutrofilia) em bovinos, é um indicador de resposta inflamatória aguda, sendo que estas alterações permanecem por tempo variável, dependendo do tipo de injúria tecidual (Kramer, 2000).
As elevações nas concentrações de fibrinogênio também são condizentes com o processo normal de cicatrização do foco cirúrgico, sendo este achado semelhante ao encontrado por Spadeto et al. (2009). O fibrinogênio é uma proteína de fase aguda, sintetizada pelo fígado, e considerada um marcador de resposta inflamatória (Jain,1993). A elevação dessa proteína está associada à ação estimuladora das interleucinas (IL-1 e 6) e do fator de necrose tumoral liberado pelo processo inflamatório (Andrews et al., 1994).
Acredita-se que a redução do hematócrito, foi influenciada pelo fato de dois animais desenvolverem um quadro de tristeza parasitária, durante a execução do experimento. Houve diagnóstico de Anaplasma marginale por esfregaço sanguíneo, sendo que em um dos casos o hematócrito chegou a 11%, necessitando de transfusão de sangue. Segundo Farias (2001) Anaplasma marginale é uma rickettsia intra-eritrocitária, transmitida por carrapatos e insetos hematófagos, além disso mecanicamente. Sendo este agente responsável pelo aparecimento de formas clínicas aguda, superaguda, leve e/ou crônica, seguido por parasitemia e intensa anemia. Na avaliação das plaquetas o decréscimo nos valores após o procedimento cirúrgico é indicativo que houve o consumo deste componente sanguíneo para o tamponamento vascular devido aos danos teciduais. Segundo Stockham e Scott (2011) as plaquetas compõem o sistema de manutenção da hemostasia, junto com a parede vascular, os fatores de coagulação e o sistema fibrinolítico. Já a trombocitose observada na quarta e quinta semana pós-operatório, acredita-se que é uma resposta medular compensatória, no entanto, a diminuição dos valores pode ter sido ocasionado devido a meia vida das plaquetas sendo que permanecem na circulação em média de 10 dias, e posteriormente são removidas por células reticuloendoteliais no baço e fígado (Andrews e Berndt, 2004).
Já avaliação dos eosinófilos a elevação nos valores pode estar relacionado a contaminação ambiental por endoparasitas visto, que os bezerros receberam vermífugo antes de serem enviados
58 para a Escola de Veterinária UFMG onde os animais provavelmente tiveram contato com ovos nas instalações que permaneceram. Segundo Coronadofonseca (1993) a elevação na contagem de eosinófilos, devido contaminação por parasitos, foi relatado em diferentes tipos de infestações, como por ácaros em ovinos (O’Brien et al., 1995) ou por larvas de Dermatobia hominis em cobaias (Coronado-fonseca, 1993)
No caso da hiperproteinemia observada na avaliação bioquímica, foi ocasionada pela elevação das globulinas, visto que os valores das albuminas se mantiveram dentro dos valores de referência. Dentre as possíveis causas da hiperglobulinemia acredita-se que ocorreu, devido ao estímulo antigênico ocasionado pelos casos de anaplasma marginale, sendo o mesmo achado observado por Sulaiman et al. (2010), Esmaeilnejad et al., (2012) e Bernardo et al. (2016).
Segundo Freire et al. (2012) a biocompatibilidade é a capacidade de um biomaterial desencadear uma resposta biológica apropriada, sem causar reações adversas como a inflamação crônica, reação de corpo estranho ou mesmo toxicidade. A classificação como irritante leve no teste em ratos e a permanência dos parâmetros hematológicos e bioquímicos dentro dos padrões de normalidade no teste em bovinos demonstram que que a haste composta de poliéster e fibra de vidro é biocompatível. Entretanto, alguns fatos indicam que o compósito pode ser mais irritante quando fragmentado, como a presença de secreção mucosa na extremidade da haste do compósito em um dos bezerros concomitante com presença de fragmentos do material e a irritação das mãos dos cirurgiões quando em contato com o pó resultante do uso da broca para perfurar a haste. Tais achados sugerem que o material deve ser usado com cuidado para evitar sua fragmentação e que talvez sejam novos testes para avaliar sua biocompatibilidade a médio e longo prazos.
Biópsia óssea.
Os objetivos da utilização da biópsia óssea foram acompanhar o processo de consolidação e observar possíveis alterações na matriz óssea ocasionadas pelo compósito de poliéster e fibra de vidro durante a evolução do processo cicatricial. Como já discutido anteriormente, os cinco animais que permaneceram no grupo experimental completaram o processo de consolidação óssea, sem alterações clínicas significativas. Segundo Mckibbin (1978) e Mandi et al. (2012), o processo de reparação óssea ocorre em seguida à resposta inflamatória inicial, com a organização do calo não mineralizado. Nessa fase ocorre a troca gradual do hematoma formado no momento da fratura, o qual atua como um arcabouço para gênese do calo ósseo. Inicialmente esse hematoma