Considerando que os TC podem produzir alguns efeitos negativos sobre o consumo e produtividade de ruminantes foi avaliado inicialmente o efeito da alimentação com Acácia sobre o consumo voluntário e peso dos caprinos. No presente estudo não houve interferência da dieta com acácia (100 mg TC/kg PV) sobre o consumo voluntário e ganho de peso nos animais que receberam a planta, quando comparado com o controle. Dessa forma, na concentração de 100 mg TC/kg PV/animal/dia não causou prejuízos ao consumo e produtividade dos animais. Outros estudos com uso de TC estão de acordo com os resultados aqui apresentados. Cenci et al. (2007) também não relataram efeito negativo sobre o peso de cordeiros alimentados com A. mearnsii (contendo 18% de TC). Minho et al. (2008b) observaram que o fornecimento de extrato de A. molissima (1,6 g de extrato kg-1 PV) por dois dias consecutivos, duas vezes ao mês a cordeiros naturalmente infectados com H. contortus e T. colubriformis também não afetaram o ganho de peso dos ovinos. Min et al. (2003) afirmaram que o efeito de TC, em concentrações moderadas, pode ser utilizado para promover aumento da eficiência de digestão de proteínas. Contrariamente, Kahiya (2003) revelou menores ganhos de peso nos animais infectados que receberam outras espécies de Acácia em sua dieta. Athanasiadou et al. (2000a) observaram que ovinos infectados tratados por uma semana com extrato de tanino condensado oriundo de Schinopsis spp.(representando 8% da dieta diária) apresentaram menor ganho de peso do que os animais controle, que não receberam a planta.
Quanto ao efeito da alimentação com Acácia sobre os parâmetros parasitológicos aqui avaliados, observamos que a alimentação com Acácia não resultou em redução de contagem de OPG e teve baixa eficiência sobre a redução da infecção por H. contortus (em torno de 15%) quando comparada a redução observada para T. colubriformis (96%). Contrariamente, Minho et al. (2008b) analisaram o efeito dos TC provenientes do extrato de A. molissima em cordeiros naturalmente infectados com H. contortus e T. colubriformis relataram que houve redução na contagem de OPG e na carga parasitária de H. contortus no abomaso quando os mesmos receberam 1,6 g de extrato (contendo 15%TC) kg-1 /PV/dia, durante 2 dias consecutivos em intervalos de 30dias, fato esse não observado na carga parasitária de T. colubriformis em intestino delgado. Considerando o % de TC contido no extrato de A. molissima, um cordeiro de 20 Kg, recebeu em torno de 4,8 g de TC dia, então 9,6 g TC por mês. Comparativamente um caprino de 20 kg que se alimentou com o pó da casca de acácia recebeu 2g de TC/dia, o que daria em torno de 30g TC mês. Em termos de fornecimento
diário os cordeiros receberam uma dose mais de duas vezes maior de TC que os caprinos deste experimento.
A dose fornecida para estes animais pode ser a principal explicação para diferente na atividade biológica das duas espécies de Acácia. Talvez doses maiores em um menor intervalo de tempo sejam fundamentais para o controle de H. contortus, mas para T. columbriformis seja mais eficiente menores doses em maior tempo de fornecimento. Ou ainda as diferenças sejam devido à espécie de hospedeiro. E quando o estudo refere-se a ovinos e caprinos é importante destacar que contrariamente aos ovinos, os caprinos apresentam adaptações fisiológicas capazes de neutralizar os metabólitos secundários das plantas, que podem interferir na atividade biológica destes compostos (Athanasiadou et al. 2007).
Entretanto, as diferenças observadas quanto à atividade biológica destas duas espécies de Acácia sobre estes dois parasitos podem também ser consequência de diferenças na estrutura química, grau de polimerização do TC ou mesmo concentração dos polifenóis em cada espécie de planta, fatores que podem influenciar diretamente na atividade anti-helmíntica sobre um determinado parasito (Reed 1995; Brunet et al. 2007). Os resultados obtidos por Kahiya et al. (2003) estudando outras duas espécies de Acácia também apóiam esta hipótese, pois ao fornecerem Acacia karoo e A. nilótica para caprinos infectados com H. contortus, observaram que somente A. karoo reduziu a contagem de ovos. Estes resultados confirmam a importância da estrutura de cada TC na sua atividade biológica e incita pesquisas que busquem conhecer a estrutura química dos compostos fenólicos de cada planta e trabalhem como estes compostos de forma isolada.
Outros fatores também podem influenciar a atividade biológica destes compostos, como a espécie do hospedeiro e parasito (Hoste et al. 2011). A diferença da susceptibilidade de H. contortus e T. colubriformis aos TC foi reportada em ensaios in vitro de desembainhamento de L3, onde catequingalato, epicatequina e epigalocatequina apresentaram atividade sobre T. colubriformis, mas não sobre H. contortus (Brunet & Hoste 2006). Os dados desses autores confirmam resultados prévios de outros estudos realizados in vivo com plantas ricas em taninos, que apresentam ação anti-helmíntica dependente da espécie de parasito e localização anatômica. Isso foi bem observado quando o tratamento com extrato de quebracho em ovinos (Athanasiadou et al. 2001) demonstraram efeitos apenas sobre as populações de parasitos do intestino delgado (T. colubriformis e Nematodirus battus) sem nenhum efeito sobre o parasito abomasal H. contortus.
Considerando estas informações, pode-se concluir que a atividade dos TC é determinada por diversos fatores e explicar as suas diferentes ações anti-helmínticas é uma tarefa difícil, que exige pesquisas mais complexas que envolvam uma avaliação minuciosa da estrutura química de cada um destes compostos, sendo ainda necessário isolá-los para que sejam determinadas suas atividades tanto in vitro com o in vivo.
Neste estudo também foi avaliado se atividade biológica das plantas estava ligada aos compostos polifenólicos. Para isso, utilizamos um grupo que consumiu o pó da casca de A. mangium associado ao polietilenoglicol (PEG), que possui a habilidade de bloquear os compostos fenólicos (Makkar et al. 1995; Makkar 2003) e inibem os efeitos anti-helmínticos caso estes sejam promovidos por compostos polifenólicos (Alonso-Díaz et al. 2008a,b). O PEG é um polímero sintético, não nutritivo que contém um número de moléculas de oxigênio suficiente para formar fortes ligações com os grupos fenólicos e hidroxilas dos taninos (Silanikove et al. 2001). O PEG se liga aos taninos com maior afinidade que as proteínas e com isso irá substituí-las nos complexos tanino-proteína, inclusive os pré-formados sem ser degradados ou absorvidos pelos animais (Lascano & Carulla 1992; Ben Salem et al. 1999).
Os resultados aqui apresentados revelaram que os animais do grupo controle e Acácia+ PEG tiveram carga parasitária de T.colubriformis semelhantes, diferindo da carga parasitária observada no grupo Acácia, que foi drasticamente reduzida. Dessa forma, concluímos que o PEG ao bloquear a atividade dos compostos fenólicos, alterou a habilidade da planta em reduzir a infecção por T.colubriformis. Dessa forma, podemos afirmar que os compostos fenólicos estão claramente envolvidos na redução da carga parasitária de T. colubriformis.
Sabendo que os linfócitos desempenham um papel importante na geração de respostas imunitárias contra helmintos (Schallig 2000) e que diversos metabolitos secundários de planta, em especial os flavonóides, podem modular a atividade de células de sistema imune (Kim et al. 2004; Lyu & Park 2005; Biesalski 2007). Neste estudo, avaliou-se o efeito da alimentação com acácia, rica em TC, um tipo de flavonóide, sobre o perfil fenotípico de linfócitos circulantes em caprinos. Através da imunofenotipicamente por citometria de fluxo, observou-se as células mononucleares do sangue periférico, positivas para as moléculas CD4, CD8 e CD21 e, através de marcação intracelular, a expressão de citocinas IL-4, IFN- e IL- 10.
Na observação do perfil fenotípico dos linfócitos, do sangue periférico de caprinos, diferenças significativas entre os grupos controle, Acácia e Acácia + PEG só foram
verificadas na avaliação realizada após 30 dias de infecção, período que pode ser associado à patência da infecção. Considerando a infecção, também verificou-se que os linfócitos B (CD21+) produtoras de IL-10 aumentaram com a evolução da infecção, em todos os grupos. Indicando que estas células têm um papel significativo na infecção, apesar de não diferir entre os grupos. A IL-10 é uma citocina com ação imunossupressora, importante no estabelecimento da tolerância imunológica do hospedeiro a infecções, atuando no controle de intensas reações inflamatórias. A IL-10 tem a capacidade de suprimir praticamente todas as citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, e ao mesmo tempo inibir a expressão de moléculas na superfície de células apresentadoras de antígenos (Doetze et al. 2000; Moore et al. 2001). Em infecções helmínticas as células B produras de IL-10, conhecidas como células Breg, desempenham um papel importante na infecção através da sua capacidade para modular as respostas de células T (Gillan et al. 2005).
Os resultados também demonstram que a evolução da infecção interage de forma significativa com a resposta imune e que infecções mais prolongadas promoveram um aumento significativo dos linfócitos avaliados. Estas diferenças podem ser reflexos da evolução cronológica das lesões que são descritas durante o curso da infecção (Barker 1975), ou ainda podem ser uma resposta ao estágio do parasito observado em cada fase da infecção. Resultados apresentados por outros estudos também observam que algumas células do sistema imune são aumentadas em períodos maiores de infecção. Bambou et al. (2013) avaliando o número de eosinófilos no sangue de caprinos só observou aumento destas células após 35 dias de infecção.
Em infecções recentes por T. colubriformis, enquanto predominam os estágios larvais, as modificações nas vilosidades são geralmente moderadas (Hoste & Reilly 1988), já na presença de formas adultas a atrofia das vilosidades é bem maior (Barker 1973a; Martin & Lee 1980). Estas mudanças observadas em cada fase da infecção podem ser responsáveis pelas mudanças na resposta imune, assim como o estágio do parasito também pode ser responsável por essas modificações (Meeusen et al. 2005). Alguns estudos com H. contortus e T. circumcinta sugerem que cada fase do parasito expressa um perfil antigênico único, que pode ser considerado como um organismo antigênico distinto no contexto da resposta imune do hospedeiro (Bowles et al. 1995; Balic et al. 2003; Meeusen et al. 2005). Nas esquistosomiasis já está bem caracterizado que as diferentes formas do parasito induzem diferentes mecanismos imunológicos no hospedeiro (Anthony et al. 2007; Burke et al. 2009)
Na avaliação do perfil fenotípico realizada após 30 dias da infecção verificou-se que os animais tratados com Acácia (grupo Acácia) tiveram um maior número de células CD4+ produtoras de IL-4 em relação ao controle, confirmando que Acácia estimulou o desenvolvimento de um perfil tipicamente anti-helmíntico e anti-inflamatório. Os linfócitos T CD4+ estão envolvidos principalmente na ativação e regulação de outras células sendo, portanto, denominados auxiliares. Células TCD4+ produtoras de citocina IL-4 estão associadas a uma resposta imune tipo Th2, bastante comum nas infecções helmínticas. A resposta tipo Th2 é caracterizada pela produção de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-9 (Urban et al. 1992; Finkelman et al. 1997). Outras citocinas, produzidas por células da resposta imune inata, como IL-21, IL-33 e IL-25, também contribuem para o estabelecimento da resposta Th2 (Anthony et al. 2007).
A resposta imune do tipo Th2 estimula uma resposta imune humoral e também a diferenciação e ativação de eosinófilos, mastócitos e basófilos, importantes fontes de IL-4 nas fases iniciais da resposta Th2 (Min et al. 2004; Shinkai et al. 2002; Anthony et al. 2007; Finkelman et al. 2004; Zhao et al. 2003; Patel et al. 2009). A IL-4 tem sido descrita como o principal estímulo para o desenvolvimento de células Th2 e também, como o principal estímulo para a produção de anticorpos IgE e IgG (Del Prete et al. 1988; Maizels et al. 2004 ), assim como também atua na regulação de células T e B e modulação de respostas inflamatórias (Robinson et al. 1997; Allen & Maizels 2011)
Diferentes trabalhos também evidenciam a participação direta de IL-4 na mucosa intestinal do hospedeiro promovendo o desenvolvimento da imunidade protetora, pois atuam em mastócitos, células epiteliais e células caliciformes produtoras de RELM- , que induzem a expulsão do parasito por meio de reações fisiológicas, como produção de muco e hipercontratilidade muscular (Zhao et al. 2003; Cliffe et al. 2005; Maizels et al. 2004; Artis et al. 2004; Herbert et al. 2009). Em algumas infecções pode também promove a formação de granuloma e ativação alternativa de macrófagos com consequente produção de arginase (Gordon et al. 2003; Anthony et al. 2006).
O aumento da produção de IL-4 por células TCD4+ observados aqui sugerem a atuação dos polifenois na modulação da resposta imune em caprinos, estimulando a produção de citocinas tipicamente envolvidas na proteção contra helmintos. O papel modulador do polifenois ou flavonóides tem sido bastante estudado tanto in vitro como in vivo com modelos experimentais (Calixto et al. 2004; Santangelo et al. 2007) e estes estudos tem atribuído aos flavonoides uma importante ação anti-inflamatória devido a habilidade destes compostos modularem a produção de citocinas pró-inflamatória (Madhavan et al. 2006).
Miles et al. (2005) avaliaram o efeito de vários compostos fenólicos sobre a produção de citocinas pro- inflamatórias e anti-inflamatória, através da estimulação in vitro de células do sangue de humanos, e observaram que um dos polifenois testados na concentração 10-4 M (molar) reduziram significativamente a produção de IFN- , mas não afetou a produção de IL- 2 e IL-4. Contrariamente nossos resultados revelaram um aumento da produção de IL-4, estimulada por polifenóis.
Os resultados apresentados por Okamoto et al. (2002) avaliando o efeito de um flavonoide, o kaempferol em células T de ratos observou que este composto fenólico suprime a produção de citocinas do tipo Th1 como IFN- e IL-2, deslocando o equilíbrio Th1/Th2 em direção a um fenótipo Th2 dominante. Liu et al. (2012) em um estudo in vivo com camundongos também demonstrou a interferência de flavonóides no equilíbrio Th1/Th2, sendo que os flavonóides levaram a um aumento da produção de IL-4 e IL-10 e inibiram a produção de IFN- e IL-2 intra-hepática. Zhong et al. (2014) também observaram uma inibição de citocinas IFN- e IL-2 e aumento da expressão de citocinas IL4 e IL-10 em leucócitos de ovelhas, estimuladas in vitro com antígenos de H. contortus e ácido tânico.
Além do aumento das células T CD4+IL-4+ no grupo Acácia, as células CD8+ produtoras de IFN- e IL-4 também foram significativamente maiores nos grupos Acácia e Acácia + PEG em relação ao controle, após 30 dias de infecção. O aumento desta resposta não só no grupo Acácia, mas também no grupo Acácia+ PEG, sugere que essa resposta não é induzida por compostos fenólicos, já que o PEG tem a capacidade de inibi-los. Dessa forma, podemos afirmar que outros compostos presentes na Acácia também atuam sobre a resposta imune em caprinos.
Os linfócitos T CD8+ são células do sistema imune adaptativo, capazes de induzir a morte de células infectadas através de mecanismos citotóxicos, assim como também podem produzir citocinas e estimular outras células do sistema imune (Shresta et al. 1998). Os linfócitos T CD8+ são importantes mediadores da resposta imune adaptativa contra determinado vírus, protozoários e bactérias patogênicas (Kimura et al. 1999; Kumar et al. 1998; Harty et al. 2000; Sud et al. 2006; Sandalova et al. 2010), mas que geralmente não estão associadas às infecções helmínticas.
A produção aumentada de IFN- , citocina pro-inflamatória, pelas células TCD8+ caracteriza um perfil de resposta tipo Th1, que está tipicamente envolvida na imunidade contra patógenos intracelulares (Boyton et al. 2002; Scollard et al. 2006). A produção desta citocina ativa e recruta macrófagos para o sítio de infecção estimulando-os a produzir outras citocinas, como o TNF-α (Boehm et al. 1997). Nas infecções por helmintos a produção de
INF- geralmente não coincide com uma resposta protetora, sendo geralmente regulada negativamente, quando isso não ocorre pode produzir prejuízos ao hospedeiro (Maizels et al. 2004).
Avaliado de forma conjunta os perfis fenotípicos dos linfócitos observados neste estudo, verificou-se que o consumo de Acácia estimulou um padrão de resposta misto como produção tanto de citocinas IFN- como IL-4, que se associam com respostas Th1 e Th2, respectivamente.
A maior parte dos estudos com metabólitos secundários em especial os flavonóides, determinam que estes compostos reduzem a proliferação de citocinas pro inflamatórias, como IFN- (Comalada et al. 2006; Wong et al. 2011). Contudo, parece que a habilidade dos compostos em modular a produção de citocinas não se refere somente a citocinas pró inflamatórias, mas também são determinadas pelo perfil imune requerido em cada infecção. Nas infecções por Schistosoma já é bem evidente o papel de citocinas pro inflamatórias e anti- inflamatórias, que se reflete em um balanço da resposta Th1/Th2, que diante das diferentes formas do parasito requer a atividade mais aguçada de Th1 ou Th2 para controlar o parasito e a imunopatologia da infecção (Grzych et al. 1991; Yu et al. 2012). Allan & Abuelsaad (2013) observou que ao tratar com hesperidina (um tipo de flavonoide) esplenócitos de camundongos infectados com Schistosoma, e estimulados in-vitro com antígenos de verme adulto e ovos, as citocinas IL-4 e IFN- foram aumentadas. Esses dados nos permitem sugerir que os metabolitos secundários modulam a responda imune, orientados pela necessidade de resposta requerida em cada tipo de infecção. Portanto, os resultados aqui obtidos parecem sugerir que a infecção dos caprinos induziu a produção de IL-4 e IFN- e os compostos presentes no pó da casca de Acácia atuaram aumentando a produção destas citocinas.
Nos ruminantes, a natureza da resposta imune contra nematóides gastrintestinais parece estar associada a uma dicotomia Th1/Th2 como tem sido observado em outros organismos (Brown et al. 1998; Pernthaner et al. 1997; Lacroux et al. 2006). Gill et al. (2000) avaliando a produção de citocinas em células de linfonodos abomasais e mesentéricos de ovinos após estimulação in vitro com H. contortus supôs haver uma polarização da resposta imune para um perfil Th2. A polarização Th2 tem sido também demonstrada em ovelhas infectadas por T. colubriformis (Pernthaner et al. 2005). Contudo, os escassos estudos em caprinos não nos permitem afirmar que haja uma polarização da resposta para Th1 ou Th2. A informação que possuímos sobre caprinos quanto aos mecanismos de controle de infecções por nematoides gastrintestinais, como H. contortus parecem ser complexos e envolvem tanto linfócitos TCD4+ como TCD8+ (Muleke et al. 2013). Os resultados apresentados neste estudo
também evidenciam a participação destes linfócitos na infecção por H. contortus e T. colubriformis em caprinos.
Talvez se o padrão de resposta fosse avaliado durante período mais longo, uma polarização da resposta imune para um padrão tipicamente anti- helmíntico com aumento de IL-4 e redução de IFN- poderia ter sido observado. A avaliação da resposta imune local, poderia também auxiliar na compreensão do padrão de resposta destes organismos na situação aqui estudada, e permitiria determinar como as mudanças sistêmicas se associam a resposta efetora contra os parasitos. A avaliação da resposta imune local poderia também nos permitir determinar se a menor eficiência da planta quanta a carga parasitária de H.contortus estava associada a uma menor resposta imune no sítio de infecção abomasal em relação ao intestinal.
Os resultados de forma geral nos permitem afirmar que o consumo de Acácia por caprinos infectados estimulou a reposta imune e promoveu uma redução da carga parasitária de T. columbriformis, que está correlacionada com o aumento da resposta imune no grupo Acácia. Contudo, não é possivel afirmar que a resposta imune foi induzida de forma indireta devido a uma mudança no status nutricional ou se os compostos fenólicos atuaram diretamente sobre as células do sistema imune no local da infecção induzindo a resposta imune observada a nível sistêmico.
Dessa forma, este estudo representa a primeira investigação sobre a atuação de compostos presentes no pó da casca de A. mangium sobre a resposta imune sistêmica em caprinos frente a infecções helmínticas e revela uma atuação promissora destes compostos sobre o sistema imune, tornando mais consistente as investigações sobre a hipótese de ação indireta dos TC.