As leishmanias suportam o compartimento hostil e tóxico de fagolisossomos de macrófagos por evasão e atenuação das funções microbicidas do hospedeiro (CECILIO et al., 2014). Leishmania tem evoluído como um parasito bem-sucedido, principalmente pela sua capacidade em modular a resposta imunológica e citoquímica do hospedeiro após a infecção. A estratégia chave para o sucesso da patogênese é a de subverter a ação das substâncias microbicidas, como o óxido nítrico, produzidas pelo macrófago infectado. Este parasito estabelece, assim, um nicho seguro nos fagócitos inativados e um parasitismo descontrolado no fígado, no baço e na medula óssea, levando a um quadro de LV sintomática, caracterizada principalmente por febre, perda de peso, hepatoesplenomegalia e anemia (PALATNIK-DE- SOUSA, 2012).
Neste trabalho, foi avaliado o potencial da associação da quimiocina CXCL10 com Glucantime® em controlar a infecção causada por L. infantum, utilizando um modelo in vitro. Trabalhos anteriores têm mostrado que o tratamento com quimiocinas é promissor no combate à infecção por Leishmania, justificado pela capacidade que algumas quimiocinas têm em induzir a polarização da resposta celular para o perfil Th1, que pode levar ao controle da infecção (DEY et al, 2007; GUPTA et al, 2009).
No presente estudo, foi observado que tanto CXCL10 como a associação CXCL10+Glucantime®, nas três concentrações utilizadas, mostrou importante redução da carga parasitária dos macrófagos infectados, com diminuição maior na concentração de 100ng/mL, 74,0% e 75,0%, respectivamente, sendo essa redução maior do que aquela induzida por Glucantime® (50,4%). Uma análise da expressão de quimiocinas em amostras de pele de cães naturalmente infectados com L. infantum demonstrou densidade aumentada do parasito e uma correlação positiva com algumas quimiocinas, entre elas, CXCL10 (MENEZES-SOUZA et al., 2012). Estudo envolvendo cães que são naturalmente ou experimentalmente infectados com L. infantum demonstrou que os animais apresentavam CXCL10 altamente expresso no baço, levando a uma resposta imunológica do tipo Th1
(STRAUSS-AYALI; BANETH; JAFFE, 2007). Foi descrito que pacientes com LV
apresentam concentrações elevadas de CXCL10 e CXCL9 no seu soro, durante a infecção ativa, sugerindo que estas quimiocinas desempenham um papel importante, juntamente com IFN-γ no controle da infecção (HAILU et al., 2004).
O provável mecanismo efetor da redução parasitária observada no presente trabalho pode estar relacionado à ativação de macrófagos induzida por CXCL10, com
eventual produção de NO, substância que controla a destruição dos parasitos nos macrófagos ativados, uma vez que tem sido relatado que algumas quimiocinas como CCL2 e CXCL10 podem ativar macrófagos, que assim participam efetivamente da redução no número de parasitos intracelulares (Ritter & Moll, 2000).
Neste trabalho, a produção de NO aumentou consideravelmente em macrófagos infectados e tratados com CXCL10, em comparação àqueles infectados e não tratados. Estudos têm mostrado que, em modelos murinos de infecção com L. major, IFN-γ apresenta ação sinérgica com TNF-α, e juntas, estas citocinas ativam macrófagos, levando ao aumento da expressão de iNOS – óxido nítrico sintase induzível, enzima que catalisa a síntese de NO a partir da arginina, um potente agente microbicida que leva à morte de parasitos intracelulares e outros microorganismos (LIEW; WEI; PROUDFOOT, 1997; BOGDAN; ROLLINGHOFF; DIEFENBACH, 2000). Mais recentemente, há trabalhos mostrando que algumas espécies de
Leishmania são resistentes à ação microbicida de NO, como alguns isolados de L. braziliensis, que exibiram significante crescimento intracelular mesmo na presença de LPS e
IFN-γ, substâncias que usualmente ativam macrófagos (SOUZA et al., 2010).
Por outro lado, a associação de CXCL10+Glucantime® não induziu a produção de NO em macrófagos em níveis comparáveis aqueles observados no grupo tratado apenas com Glucantime®. Apesar disso, foi observada redução da carga parasitária, mesmo com pouca indução de NO, o que pode sugerir que, no presente trabalho, a redução de parasitos in vitro não depende exclusivamente de NO, apontando para a participação de outros mediadores na redução dos parasitos intracelulares. Há relatos de que outros produtos do metabolismo do oxigênio estão envolvidos na explosão respiratória em macrófagos murinos ativados, como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o ânion superóxido (O2-), colaborando com a eliminação dos
parasitos (VAN ASSCHE et al., 2011).
Foi observado também que a medida que a concentração de CXCL10 foi aumentada na associação com Glucantime®, ocorreu redução da produção de NO. Esses dados levantam duas hipóteses, a primeira de que a associação CXCL10+ Glucantime® talvez esteja causando inibição da produção de NO, e a segunda de que, talvez as concentrações usadas nas associações já atingiram seu efeito máximo. Na literatura não foi encontrada referências de que ocorra a inibição do efeito da associação de Glucantime® com outros fármacos ou citocinas, portanto, a segunda hipótese parece a mais plausível. Outros experimentos utilizando concentrações menores de Glucantime® poderiam esclarecer esse achado.
A análise das citocinas mostrou que CXCL10, associada ou não a Glucantime® induziu maior produção de IL-12. Dados da literatura mostram que a carga parasitária pode diminuir em camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis e tratados com CXCL10, e isso é mediado por IFN-γ, IL-12 e NO (VASQUEZ; SOONG, 2006). IL-12 é uma citocina crítica, necessário para desenvolvimento de células CD4 + Th1 e produção de IFN-γ. Embora macrófagos fagocitem a Leishmania de modo eficiente, há evidências de que a sua capacidade de produzir IL-12 é prejudicada seletivamente pelos parasitos. Além disso, os macrófagos ativados produzem também TNF, que atua de uma maneira autócrina para aumentar ainda mais a produção de radicais livres microbicidas por macrófagos (LIU; UZONNA., 2012).
Corroborando com a resposta protetora representada pelo aumento da produção de NO, o tratamento com CXCL10 e sua associação com Glucantime® induziram diminuição significativa de IL-10, citocina anti-inflamatória e presente em altos níveis na fase ativa da doença, e CXCL10 sozinho induziu também redução de IL-4, citocina de assinatura da resposta de perfil Th2, sugerindo um papel de CXCL10 na mediação da polarização da resposta imunológica; de Th2 para Th1, em macrófagos infectados com L.
infantum.
O estabelecimento da leishmaniose tem sido relacionado à polarização de resposta de células T CD4+ subtipo Th2. Camundongos BALB/c infectados com L. major se mostram incapazes de controlar a disseminação do parasito e o desenvolvimento da doença acaba levando o animal à morte. Esta incapacidade de controlar a doença está relacionada com a resposta precoce do tipo Th2, que se inicia e se mantém a partir de células T CD4+ secretoras de IL-4, resultando em ativação de células B policlonais (CHATELAIN; VARKILA; COFFMAN,1992).
A aparente cura da infecção por L. major em camundongos BALB/c tratados durante o curso da infecção com anticorpos monoclonais anti-IL-4 (SADICK, 1990) ou em camundongos knockout para IL-4 (KOPF et al., 1996), fornecem sólidas evidências de que a produção precoce de IL-4 polariza a resposta imunológica para Th2, que é responsável por suprimir o desenvolvimento de células Th1 e por consequência também, o nível de IFN-γ necessário para a ativação de macrófagos infectados. Entretanto, em pacientes portadores de LV, há um aumento no nível de produção de múltiplas citocinas e quimiocinas, e muito da resposta parece ser pró-inflamatória, como é indicado pelo elevado nível plasmático de IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, CXCL10, IFN-γ e TNF-α (MEDEIROS et al., 1998; ANSARI et al., 2006; KURKJIAN et al., 2006).
IL-10 é outra citocina produzida por macrófagos que contribui para a sobrevivência de Leishmania nestas células, relacionada como um dos fatores mais importantes para a patogênese da LV. IL-10 inibe a síntese de citocinas produzidas por macrófagos, tais como IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α (DE WALL et al., 1991) e reduz a função de apresentação de antígenos nestas células, através da diminuição da expressão de moléculas de MHC classe II (DE WALL et al., 1991). A associação de IL-10 e LV em seres humanos com doença ativa é bem estabelecida (NYLEN, 2007). IL-10 é uma citocina regulatória que pode ser produzida também por células T, B, células dendríticas e epiteliais, e acredita-se que seja induzida como uma resposta de equilíbrio homeostático que protege tecidos de dano colateral causado por inflamação excessiva (MOORE et al., 2001; MEGE et al., 2006).
Na LV, a imunossupressão mediada por citocinas está relacionada com a alta produção de IL-10 e TGF-β (MURRAY et al., 2002). Estudos envolvendo camundongos deficientes em IL-10 mostraram que estes são altamente resistente à LV (MURRAY et al., 2002; KAYE et al., 2004). Esta citocina também prejudica a capacidade de resposta para antimônios pentavalentes. Em modelos experimentais de LV, o tratamento com anticorpos monoclonais contra o receptor de IL-10 permitiu uma redução de 10 vezes na eficácia da dose de antimônios pentavalentes em comparação com o fármaco por si só, bem como considerável encurtamento do tempo necessário para uma terapia eficaz (MURRAY et al., 2002; SHAKYA et al., 2012).
No presente estudo, CXCL10 sozinho induziu uma produção significante de TNF- α com 48 horas, assim também como a associação CXCL10+Glucantime®. Além de IFN-γ, TNF-α também está envolvida na ativação de macrófagos e na regulação positiva da expressão de iNOS, levando à produção de NO (CECILIO et al., 2011). TNF-α desempenha, portanto, o papel de citocina sinalizadora do disparo para o geração de NO (BHATTACHARYYA et al., 2002). Estudos mostram que a produção de altos níveis de IFN-γ e TNF-α levam ao controle da infecção (GOMES-SILVA et al., 2007; SCHNORR et
al., 2012). Os altos níveis de TNF-α favorecem a ativação das células apresentadoras de
antígeno, aumentando então a capacidade das células T CD4+ de produzirem IFN-γ (OLIVEIRA et al., 2014).
Recentes abordagens como a terapia de combinação, a administração orientada e o uso de adjuvantes imunológicos são esforços para reduzir as doses eficazes de fármacos disponíveis no mercado e que apresentam altas toxicidades, como os antimoniais pentavalentes, entre eles o Glucantime® (SINGH; SUNDAR, 2014). Estudos com quimiocinas in vitro e in vivo demonstraram restauração da resposta efetora, indicando que
estas moléculas desempenham importante papel em restringir a progressão da infecção por
Leishmania (DEY et al., 2007). A quimiocina CXCL10, por sua vez, estimula a produção de
citocinas de perfil Th1 em infecção por L. amazonensis (VASQUEZ; SOONG, 2006) e L.
infantum (FIGUEIREDO et al., 2017), desempenhado importante papel imunoprotetor em
modelos in vitro e in vivo de L. donovani e L. infantum, direcionando a resposta imunológica para uma resposta efetora pró-inflamatória (GUPTA et al., 2009; FIGUEIREDO et al., 2017).
Coletivamente, os dados deste trabalho mostra um importante papel protetor da associação da quimiocina CXCL10 com Glucantime®, em macrófagos RAW 264.7 infectados por L. infantum, proteção esta, mediada por produção de NO e citocinas proinflamatórias (IL-12 e TNF-α) e diminuição de citocinas imunorreguladoras (IL-4 e IL- 10). Os dados desse trabalho podem fornecer informações para o desenvolvimento de futuras intervenções terapêuticas para a leishmaniose visceral, utilizando CXCL10 como adjuvante, associado ou não aos antimoniais pentavalentes.
7 CONCLUSÃO
Pode-se concluir que o tratamento in vitro com CXCL10 isolado ou com a associação CXCL10+Glucantime® foi capaz de reduzir a carga parasitária dos macrófagos infectados, redução essa maior do aquela observada nos macrófagos tratados apenas com Glucantime®, e induz aumento na produção de NO, IL-12 e TNF-α e supressão de IL-10 e IL-4, apresentando um efeito imunoprotetor em macrófagos RAW 264.7 infectados por L. infantum;
Pode-se sugerir que o tratamento in vitro com CXCL10 isolado ou associado ao Glucantime® estimula uma importante resposta efetora pró-inflamatória através da indução da produção de citocinas de perfil Th1, o que pode fornecer informações para o desenvolvimento de futuras intervenções terapêuticas na leishmaniose visceral, utilizando CXCL10 como adjuvante, associado ou não aos antimoniais pentavalentes.
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