Os resultados gerados no segundo dia (Dia 2 – Expressão) do presente estudo (visualizados nas Tabelas 4 e 5) possibilitaram a observação de alguns pontos a serem destacados, dentre eles pode-se verificar que animais que não receberam a estimulação nociceptiva nem o tratamento farmacológico (Grupos 1 e 3) não demonstraram preferência por algum ambiente. Além disso, foi demonstrado que, pelos tempos obtidos nos Grupos 5 e 7, animais que receberam estimulação nociceptiva pela injeção de formalina e não receberam tratamento farmacológico, demonstraram preferência pelo ambiente oposto ao qual foram pareados com o estímulo nociceptivo, expressando a aversão condicionada por lugar (ACL) ao ambiente no qual foram confinados no primeiro dia de experimento. Tal observação corrobora estudos anteriores como os de Gray e McNaughton (2000) e McNaughton e Corr (2004), nos quais se demonstra que a aproximação da fonte de perigo gera a ansiedade traduzida nos animais pela exibição de respostas de defesa como a esquiva que foi observada ao local em que foi aplicado o estímulo aversivo, neste caso a dor. Em outras palavras, a injeção de formalina fez com que os animais evitassem o compartimento com o qual foi pareada. Assim, no dia seguinte à injeção de formalina, os animais permaneceram mais tempo no ambiente oposto ao que foi confinado, denotando ACL.
Entretanto, a aplicação de alprazolam em alguns grupos de animais atenuou a ACL, já que, mesmo com a aplicação do estímulo nociceptivo, os animais continuaram preferindo o compartimento A (Tabela 5, Grupo 6). No caso daqueles que foram confinados em B, a aversão também foi atenuada, uma vez que o grupo tratado com alprazolam não se esquivou deste compartimento e deixou de exibir preferência pelo compartimento oposto (Tabela 5, Grupo 8), demonstrando ausência
de preferência. Neste sentido a conotação aversiva que o contexto (pareamento dor e compartimento) induziu nos animais submetidos à formalina, deixou de existir nos animais tratados com alprazolam, pois, mesmo tendo recebido o estímulo nociceptivo no dia anterior, os animais não evitaram o ambiente aversivo, tal como fizeram os animais não tratados com o ansiolítico.
Estudos anteriores como de Donaldson e colaboradores (2003), já pontuaram que a dor é capaz de induzir respostas comportamentais que envolvem fuga e/ou esquiva, procurando defender o organismo daquele potencial dano tissular. Tais respostas são geradas provavelmente pelo fato de que o processamento da dor envolve a ativação e/ou inativação de vias neurais centrais e periféricas que vão além das vias sensoriais, como, por exemplo, os tratos ascendentes espino- talâmicos e espino-reticulares e também as vias modulatórias descendentes inibitórias e facilitatórias da dor. Tais vias transmitem ou possuem ramificações neuronais em diversas áreas do sistema límbico, um conjunto de estruturas responsáveis pelo controle e expressão das emoções. Neste sentido, as ramificações ou mesmo estações sinápticas fazem com que a informação que chega até os centros processadores da dor, como tálamo e o córtex sensorial, sofram influências de estados emocionais. Em outras palavras, a dor pode tanto interferir no controle das emoções como também sofrer influência das emoções. Assim, estruturas límbicas como locus coeruleus (LC), matéria cinzenta periaquedutal (MCP), amídala, hipotálamo e outras, conectadas com o tálamo e córtex, modulam a resposta nociceptiva e, além disso, conferem um valor emocional à dor. Por este motivo, a dor não deve ser tratada somente levando-se em consideração aspectos fisiológicos e sensoriais, mas também como uma sensação subjetiva, com um componente emocional relevante, o qual modula sua expressão.
Neste estudo, o aspecto aversivo do estímulo nociceptivo (provocado pela formalina) foi avaliado pela sua associação com o ambiente em que a injúria foi aplicada, gerando uma emoção negativa. Neste sentido, ao ser colocado no aparato no dia seguinte, o animal identifica este ambiente, passando a se esquivar dele, aumentando seu tempo de permanência no ambiente oposto. Este comportamento também parece ser mediado pela ativação dessas áreas límbicas que reconhecem a dor como o estímulo aversivo capaz de ameaçar a integridade corporal, provocando a resposta de esquiva do animal ao compartimento no dia seguinte à injeção de formalina. De fato, Sokolov (1990) descreveu que o hipotálamo, uma área encefálica relacionada com respostas de defesa, também está envolvido no processamento da dor, e sua ativação em resposta a estímulos nociceptivos é capaz de desencadear respostas mediadas pelo próprio hipotálamo e conexões centrais, bem como através da ativação do sistema nervoso simpático em resposta à injúria o que provocaria além da esquiva, reações autonômicas como elevação da pressão arterial, taquicardia e outras respostas relacionadas. Além disso, Graeff (1994) relacionou que a ativação da MCP medeia reações de fuga e esquiva em animais submetidos a estímulos dolorosos. Além desses sítios citados, Davis (2000) identificou, através de tomografia, uma série de sítios límbicos ativados em situações em que humanos conscientes sentiam dor como pinçamento e outros testes. Sob tais condições, o escaneamento encefálico mostrou ativação do córtex pré-frontal medial, núcleos talâmicos e MCP.
Neste sentido, baseados nestes e em outros estudos da literatura, é possível sugerir que a exposição do animal à dor tenha ativado uma ou mais áreas límbicas, gerando a esquiva ao compartimento e, portanto, a ACL. Além disso, é possível que o tratamento com o ansiolítico tenha atenuado o grau de ativação dessas áreas,
diminuindo a aversividade da associação dor × compartimento. Uma vez que é conhecido que fármacos benzodiazepínicos atuam potencializando a neurotransmissão GABAérgica nos receptores GABA-A, e, portanto, diminuindo a excitação dessas áreas relacionadas a mediação da ansiedade, tal situação pode fazer com que o compartimento, ainda que seja o mesmo no qual o animal sofreu com a dor induzida pela formalina, tenha menor conotação aversiva. Esta hipótese fundamenta-se na conhecida propriedade ansiolítica do alprazolam bem como pelo seu efeito em diminuir a esquiva do ambiente pareado com o estímulo nociceptivo.
Existem poucos trabalhos que utilizam a formalina como indutor de ACL, entre eles está o de Johansen e colaboradores (2001) no qual ratos confinados em um ambiente neutro após sofrerem injeção intraplantar de formalina, evitavam o compartimento no dia seguinte ao confinamento, da mesma forma que neste trabalho com camundongos. Nesse estudo, os autores demonstraram que a lesão do córtex pré-frontal medial, mais especificamente da porção rostral do cingulado anterior, abolia a aversão condicionada por lugar, sem alterar o efeito agudo da formalina em animais não submetidos ao condicionamento aversivo, sugerindo o envolvimento de um componente emocional à dor.
Ainda com respeito ao condicionamento aversivo, outro teste baseado na esquiva de um compartimento pareado a uma situação aversiva é o teste conhecido como “shuttle box” ou caixa vai-e-vem. De modo sucinto, neste teste o animal é colocado em uma caixa com dois compartimentos, onde recebe um choque na pata fazendo com que ele saia do compartimento em direção ao outro. Segundo Tang e colaboradores (1991), a aplicação de diazepam diminuiu a resposta de esquiva em animais treinados na caixa de vai-e-vem, denotando efeito ansiolítico. Assim, para os animais tratados com diazepam, o choque exprimia uma menor característica
aversiva que para aqueles tratados com salina, da mesma maneira que, no presente estudo, os animais tratados com alprazolam não exibiram aversão ao ambiente que estavam com dor, como exibidos pelos animais controles.