Desde que foi descoberto que a N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina induz o desenvolvimento de neoplasias na bexiga de murganhos e outros roedores (Akagi et al.,1973; Oliveira et al., 2007; Kunze et al., 1976). Esta nitrosamina é um composto químico, mas existem imensas nitrosaminas no meio ambiente que podem induzir o desenvolvimento de cancro em humanos. Pode ser através da alimentação (cerveja, queijos, carnes e peixes curados), da indústria (pele, borracha e metais), tabaco, agricultura (pesticidas e herbicidas), cosméticos e produtos farmacêuticos (exposição às nitrosaminas preformadas) (Fonseca e Jesus, 2003). Segundo Vasconcelos et al. (2012) este composto químico tem também a propensão para induzir mutações que afetam a expressão de vários genes. O cancro da bexiga é uma doença heterogénea e muito frequente a nível mundial. Quando os tumores são de baixo grau, requerem tratamento endoscópico e vigilância, raramente apresentam uma ameaça para o paciente. Mas quando têm um alto potencial maligno são progressivos e têm elevadas taxas de mortalidade (Kirkali et al., 2005). Depois das doenças cardiovasculares é o cancro da bexiga que mais mata em todo o mundo e o seu desenvolvimento tem fatores endógenos e exógenos (Gutiérrez e Salsamendi, 2001). Na pesquisa efetuada verificamos a existência de imensos estudos com a N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina induzindo tumores de bexiga em murganho e ratos, assim como vários compostos que podem inibir a indução e o desenvolvimento dos tumores (Becci et al., 1978; Yang et al.,1997; Oliveira, 2006). Mas em nenhum dos trabalhos encontrados foi estudado o impacto da BBN na microbiota intestinal dos murganhos. Pois a BBN pode ser induzida nos murganhos de várias maneiras e uma delas é através da água de bebida, sendo depois absorvida pelo intestino. Uma vez que esta nitrosamina é capaz de induzir tumores de bexiga, poderá causar também alterações a outros níveis, como por exemplo na microbiota intestinal e foi o que se estudou no ensaio realizado. Poucos são também os trabalhos onde se tentou contabilizar ou identificar a microbiota intestinal dos murganhos. O trabalho mais semelhante com o presente estudo foi o de Schaedler et al. (1965) em que tentou fazer o isolamento das bactérias existentes na microbiota intestinal e quais as primeiras bactérias a colonizarem o intestino após o nascimento. Este trabalho foi depois desenvolvido por Dewhirst et al. (1999) que identificaram as espécies que Schaedler et al. (1965) tinham referido através da análise das sequências 16S rRNA e fizeram a filogenia entre as espécies. Um outro trabalho foi o de Friswell et al. (2010) que utilizaram várias estirpes de murganhos e tentaram identificar as
espécies utilizando as técnicas de PCR e PCR-DGGE. Existem depois muitos outros trabalhos onde se pretendeu testar a introdução de bactérias estranhas ou da própria microbiota, mas em elevadas quantidades e, testarem químicos, mas em nenhum dos trabalhos encontrados foi testado o efeito que a N-Butil-N-4-hidroxibutil nitrosamina apresenta na microbiota intestinal. Muitas são as bactérias que podem ser encontradas na microbiota intestinal e alguns dos géneros que podem ser isolados já foram referidos anteriormente no ponto 1.5 deste trabalho. Entre esses géneros, as bactérias de morfologia cocóide e Bacillus spp. que fazem parte da microbiota normal do murganho. Estas foram encontradas em elevado número sendo de salientar que a sua quantidade aumentou após o tratamento com a BBN em ambos os grupos, mas estatisticamente o aumento não foi significativo. O que sucedeu também com os géneros
Enterococcus spp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus spp.
Streptococcus spp. apresentou uma diferença entre os dois grupos, pois no Grupo 1 a
quantidade de Streptococcus spp foi superior no subgrupo B1 e, no Grupo 2 a quantidade foi
superior no subgrupo A2, mas a diferença não foi estatisticamente significativa. Esta diferença
pode ser justificada pelo facto de neste grupo terem sido isolados um menor número de géneros bacterianos. O mesmo acontece com o género Rhizobium radiobacter, mas este género bacteriano não é uma bactéria que faça parte da microbiota normal dos murganhos. Está bactéria é apenas patogénica para as plantas e humanos com baixa virulência. Normalmente, encontra-se nos solos e sobrevive como um organismo saprófita. Tem vindo a ser isolada em fluidos de diálise e amostras clínicas (Barrow e Feltham, 1993; Detrait et al., 2008). Segundo Detrait et al. (2008) esta bactéria é frequentemente isolada em pacientes com Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), mas foi também isolada em dois pacientes, uma com um carcinoma nos ovários e outro paciente que admitiu ter a bactéria em casa e apresentava sintomas de choque séptico e colecistite aguda. Ultimamente esta bactéria tem sido isolada em seres humanos e em vários tecidos e de vários locais, principalmente em pessoas imunodeprimidas (Detrait et al., 2008). A maioria dos trabalhos que se referem a esta bactéria falam essencialmente da sua interação com plantas e muito poucos da interação com humanos. Nenhum se referiu ao seu isolamento em animais, tais como, os murganhos. O facto de Rhizobium radiobacter existir na microbiota intestinal destes animais poderá estar associado a alimentação que era adquirida de Itália (Mucedola/ laboratory rodent diet) ou através da cama que revestia as gaiolas. Rhizobium radiobacter são bacilos Gram negativos, móveis, catalase e oxidase positivas, metabolismo oxidativo, aeróbias, urease positiva, e utiliza hidratos de carbono (Barrow e Feltham, 1993). Esta bactéria tem vindo a ser algo de diversas controvérsias, pois foi classificada por Conn (1942) como género Agrobacterium,
mas devido a estudos de genética foram comparados os géneros bacterianos através do gene 16S rRNA e concluiu-se que o mais correto é pertencer ao género Rhizobium (Young et al., 2001).
As bactérias da espécie Eubacterium lentum foram apenas isoladas na primeira recolha, estas bactérias fazem parte da microbiota dos murganhos e dos humanos (Carter et al., 1995; Ferreira e Sousa, 2000). Aeromonas salmonicida encontra-se na água, sendo patogénica para os peixes (Figueras et al., 2000). Mesmo quando as águas são tratadas existe sempre uma quantidade mínima destas bactérias na água, mas que não são prejudiciais e por esse motivo a água é própria para consumo (Martin-Carnahan e Joseph, 2005). O facto de não existirem no Grupo 2 ou pelo menos não foram isoladas, pode significar que os animais do Grupo 1 estiveram expostos à bactéria e os do Grupo 2 não. Normalmente os animais são contaminados com esta bactéria quando ingerem águas contaminadas e peixe contaminado (WHO, 2004), o que leva a querer que estes animais que apresentam a bactéria na sua microbiota intestinal devem ter ingerido água contaminada ou poderão ter vindo contaminados da própria empresa a onde foram adquiridos. Uma vez que a água que ingeriram foi comprada, levanta-se a questão se está água estaria contaminada por Aeromonas
salmonicida. Já a espécie Clostridium sporogenes somente foi isolada na segunda recolha.
Este género é muito frequente a nível da microbiota intestinal, assim como, esta espécie (Brown et al., 2012). No Grupo 2 existe em elevada quantidade que diminui após a indução da BBN e é estatisticamente significativa. O que revela que após a indução da BBN este o número destas bactérias diminuiu. Ao contrário deste género, as bactérias do género
Pasteurella foram isoladas apenas numa amostra fecal originária do grupo controlo (Grupo
1). No subgrupo B1 do mesmo ensaio não se encontrou esta bactéria. Normalmente, fazem
parte da microbiota comensal do trato respiratório superior e trato intestinal de maníferos e aves (Carter et al., 1995; Ferreira e Sousa, 2000).
Actinomyces israelli isolou-se em ambos os Grupos, existindo em elevado número no
Grupo 1, aumentado em ambos após a indução da BBN, não sendo estatisticamente significativo. Este género faz parte da microbiota intestinal dos murganhos e do homem, encontrando-se nos solos. Provoca doenças em humanos através de vários processos infeciosos, é um agente patogénico oportunista. Como o descrito no ponto 1.1.5.1, provoca actinomicose no homem (Ferreira e Sousa, 2000). A actinomicose é uma doença inflamatória granulosa de evolução subaguda ou crónica. A reação é habitualmente supurativa com formação de abscessos contendo grânulos. Ocorre esporadicamente em humanos e outros animais, não é contagiosa. O diagnóstico pode ser confirmado por exame microbiológico
cultural (Ferreira e Sousa, 2000). Estas bactérias podem ser benéficas mas as vezes tornam-se patogénicas. O mesmo sucede-se com o género Clostridium, isto porque estas bactérias têm fatores de virulência.
Escherichia coli é uma das bactérias mais estudadas e que faz parte da microbiota
intestinal da maioria dos animais e inicia por vezes, a colonização no trato urinário logo após o parto e permanece ali ao longo da vida, sendo geralmente inofensivo (Carlos, 2009). Neste ensaio em nenhum dos grupos foi isolado este género. Esta bactéria é muito persistente e não morre facilmente. Sendo muito estranho o não isolamento, mesmo porque algumas das amostras foram enriquecidas com água peptonada, assim como, Scaife (2005) fez para o isolamento desta bactéria em ratos selvagens. Mas nem deste modo apareceram colónias nos meios utilizados com as características morfológicas. O seu isolamento pode também não ter sido possível pois como, o referido por Alcântara et al. (1996) quando se usa uma amostra natural, contendo populações mistas de microrganismos, mesmo utilizando meios complexos, apenas se consegue detetar uma pequena quantidade dos microrganismos presentes na população inicial. Segundo Casarin (2005) este género bacteriano aparece muito em hambúrgueres para consumo. No trabalho realizado testou-se se realmente existia Escherichia
coli e Staphylococcus aureus. Se sobreviviam a temperaturas baixas e qual a sua quantidade
ao longo do tempo que os hambúrgueres permanecem congelados. A conclusão que o autor chegou foi que nas amostras que serviram de controlo não foi possível o seu isolamento da
Escherichia coli e apenas se isolaram nos hambúrgueres que foram contaminados e estas
sobreviveram durante o tempo de congelamento que foi um mês. Quanto a Staphylococcus
aureus este foi isolado nas amostras controlo e também sobreviveram ao tempo de
congelamento. Normalmente, os microrganismos não se desenvolvem a temperaturas muito baixas, próximas dos 0ºC, isso porque as reações metabólicas dos microrganismos são catalisadas por enzimas e são dependentes da temperatura. A diminuição da temperatura reduz a taxa de reação (Jay, 2000). Alguns organismos desenvolvem também certos mecanismos de resistência ao choque térmico, tais como, a modificação da composição dos hidratos de carbono da membrana plasmática, absorção de betaína, prolina e carnicina que funcionam como osmoprotetores e a produção de proteínas de choque frio (Forsythe, 2000). Existem também fatores que afetam a resistência durante o congelamento, como a velocidade de congelamento (Geiges, 1996; Jays, 2000), temperatura de congelamento, tempo de congelamento (Delazari, 1980), velocidade e temperatura de descongelamento (Jay, 2000). Num outro estudo realizado por Sousa (2011), testou-se a sensibilidade de Escherichia coli a
temperaturas de ebulição e congelamento. E concluiu-se que com o passar do tempo a quantidade de Escherichia coli em Mytella falcata congelada vai diminuindo.
Esta investigação foi um trabalho fenotípico, onde todas as bactérias isoladas foram identificadas por métodos tradicionais de microbiologia, e quando não era possível a sua identificação assim, recorria-se ao uso de galerias API. Todos os géneros isolados foram guardados em meio de leite para o caso de posteriormente ser possível a realização de outro tipo de estudos, como por exemplo, estudos de genética molecular. Num estudo de genética molecular pode-se chegar em concreto as espécies existentes e subespécies utilizando métodos como os descritos no ponto 1.7.1.2 deste trabalho. Como exemplo, um dos trabalhos feitos por Dewhirst (1999) e colaboradores foi completar o trabalho inicial de Schaedler et al. (1965). Onde fizeram um estudo genótipico das bactérias, para completar o estudo e ter uma maior certeza sobre as bactérias que realmente existiam na microbiota- Dewhirst et al. (1999) fizeram a cultura de bactérias, até obter as colónias puras e depois procederam à extração de ADN para amplificar o operão 16S rRNA para analisar as sequências e caracterizar quanto à sua posição filogenética com as bactérias já conhecidas. Foram feitos PCR convencionais. Este tipo de estudo poderá ser feito no futuro sobre os resultados do presente trabalho para caracterizar genotipicamente as espécies e géneros existentes na microbiota intestinal dos murganhos deste ensaio.
Relativamente ao meio de PCA pode-se observar que em ambos os Grupos as amostras que foram inoculadas com 1 ml de amostra, têm um número incontável de UFC. Quanto ao meio de PCA inoculado com 100 µl de amostra existe um menor número de UFC, sendo possível contabiliza-las. Mas no Grupo 1 existe um maior número de UFC incontáveis o que pode justifica-se pelo facto de neste grupo terem sido isolados mais géneros bacterianos. No Grupo 2 apenas uma das amostras do grupo controlo e uma das amostras expostas à BBN foi incontável o número de UFC, nas restantes amostras o número é inferior a 300 sendo possível contabiliza-las. Este menor número de UFC poderá ser justificado pelo facto de existir um menor número de géneros bacterianos.
7. Conclusões
Com a realização deste ensaio pretendeu-se estudar a microbiota intestinal de murganhos ICR, com estatuto microbiano convencional durante um ensaio de carcinogénese química do urotélio. Após a realização de todo o trabalho os resultados sugerem que os animais podem não ter uma microbiota intestinal convencional e que podem vir com a microbiota diferente da esperada quando se efetua a aquisição, o que muitas vezes poderá alterar os resultados dos fins experimentais para que foram adquiridos. Como exemplo, neste ensaio foi isolado o género Rhizobium radiobacter, que não faz parte da microbiota intestinal. Como o resultado estatístico deste género foi significativo relativamente ao subgrupo A2, do Grupo 2, conclui-se
que a BBN pode ter diminuído o número destas bactérias.
Em um dos Grupos também não foi isolado o género Clostridium e Pasteurella e estas bactérias fazem parte da microbiota. Como o resultado estatístico de Clostridium sporogenes foi significativo e a sua quantidade diminuiu após a indução da BBN, pode-se concluir que a indução pode diminuir o número destas bactérias a nível da microbiota intestinal.
O género Escherichia coli não foi isolado. Com a avaliação dos resultados observou-se também uma variação a nível da microbiota intestinal, pois nos animais do Grupo 2 foram isolados menos géneros bacterianos o que sugere que a microbiota intestinal dos animais do Grupo 1 era diferente do Grupo 2, o que é normal. Quanto à indução da BBN concluiu-se que o efeito sobre a microbiota intestinal não foi significativo a nível estatístico, mas aumentando o número de amostras, o resultado poderia ser diferente.
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