Discussão geral, conclusões e perspectivas

Nos últimos anos melhorias substanciais nos métodos de genotipagem mudaram as

abordagens utilizadas para identificação das mais diferentes espécies. Este passo envolveu

grandes avanços em bioinformática, e mesmo na automação dos métodos de genotipagem.

Outro fator preponderante para tal melhoria são as bases de dados genômicos, as quais

atualmente encontram-se em constante atualização e permitem avaliações rápidas e fáceis

entre dados obtidos por distintos laboratórios, facilitando comparações fidedignas entre

distintos grupos de pesquisa. Todos estes fatores juntos permitem que técnicas alternativas

ao sequenciamento de DNA sejam desenvolvidas e empregadas com maior eficiência e

precisão auxiliando na identificação e diferenciação de espécies.

O DNA mitocondroal é largamente utilizado para discriminação de organismos

intimamente relacionados, devido a sua taxa de evolução relativamente rápida, se

comparado à maioria dos genes nucleares em um dado organismo, e sua herança

exclusivamente materna. O sequenciamento do gene cox1, utilizado desde 1992 nas

análises moleculares com o intuito de identificar as variantes genotipicas existentes entre

as espécies do gênero Echinococcus, tem sido empregado para a determinação de um

grande número de espécies. Como resultado do sequenciamento em massa do fragmento de

cox1 o GenBank, banco de dados de acesso público, possui atualmente mais de 214.000

sequências do gene, sendo a espécie E. granulosus a décima oitava com maior número de

sequencias depositadas, totalizando 798 (05/04/16). Embora o gênero Echinococcus seja

atualmente compreendido por dez espécies, o número de sequencias depositadas para as

nove espécies restantes restringe-se a 319. Se levarmos em conta a existência de variações

haplotípicas descritas para diferentes populações das espécies de Echinococcus,

146

visualizaremos um panorama dispendioso financeiramente, para um laboratório interessado

em identificar corretamente o material com que trabalha rotineiramente. Além disso, outro

agravante do sequenciamento de DNA é o tempo dispendido tanto para a preparação das

amostras como para a identificação e diferenciação dos indivíduos de uma população.

Com o intuito de facilitar o processo de varredura de novos genótipos e a

identificação dos já descritos, diferentes técnicas de genotipagem vem sendo empregadas,

as quais diminuem os custos e o tempo associados à análise, devido à redução substancial

(geralmente 70-90%) do número de amostras a serem sequenciadas (Jabbar & Gasser,

2013). A rotina de trabalho com amostras provenientes do cisto hidático inclui a

identificação do genótipo e/ou espécie associado ao material coletado. Existem na fase

larval deste parasito, duas frações biológicas das quais são possíveis à extração de DNA

em quantidades suficientes para a identificação do parasito, os protoescólices e a camada

germinativa (McManus, 2006; Balbinotti et al., 2012). Este fator é um limitante para

muitos estudos funcionais, os quais necessitam usar o material parasitário coletado para a

obtenção de RNAs e proteínas. Uma alterntiva para tal problema deu-se com a

experimentação e posterior emprego de uma rotina na qual a extração de DNA passou a ser

realizada a partir de uma quantidade mínima de material biológico, 10-20 protoescólices

(Haag et al., 2004; Balbinotti et al., 2012). O emprego desta metodologia levou a uma

diminuição considerável do material utilizado para genotipagem, possibilitando a

utilização do mesmo para extração de outras biomoléculas.

Atualmente o custo aproximado de uma reação de sequenciamento é de 20 reais,

sendo que para a obtenção de uma sequência nucleotídica de boa qualidade e

consequentemente confiável o suficiente para a identificação da espécie do parasito, são

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necessários ao menos duas reações distintas de sequenciamento, direta e reversa, o que

eleva o custo por amostra biológica a cerca de 40 reais. Mais que o valor agregado ao

sequenciamento, o tempo empregado na marcação, purificação, injeção da amostra, além

da análise computacional podem totalizar mais 48 horas de procedimento. Cada abordagem

metodológica possui vantagens e desvantagens, sendo que uma ou mais abordagens para

genotipagem podem ser utilizadas, dependendo do ambiente do laboratório, apoio

financeiro disponível, e da disposição de material biológico. Com o intuito de diminuir os

custos e principalmente o tempo empreendido em tal procedimento, a técnica de HRM

surgiu como alternativa ao processo de amplificação seguido de sequenciamento.

Em estudo onde a alteração de uma única base foi sistematicamente investigada em

fragmentos que variavam de 50 pb até 1000 pb com conteúdo GC entre 40-60%

concluiu-se que para produtos de PCR de até 400 pb a concluiu-sensibilidade e especificidade para detecção

de polimorfismos de base única por HRM é de 100%. Já para produtos de PCR de 400 até

1000 pb a sensibilidade e especificidade ficaram respectivamente em 96 e 99% (Reed &

Wittwer, 2004). Também é importante levar em consideração o uso do fluoróforo mais

adequado, que forneça maior flexibilidade de uso, custo reduzido, e que permita a análise

precisa das curvas de dissociação geradas a partir da separação dos produtos de PCR (Ririe

et al., 1997; Buh et al., 2010). Apesar da grande variedade de fluoróforos comercialmente

disponíveis, a imensa maioria das reações de PCR quantitativo em tempo real é realizada

utilizando-se o corante SYBR Green. Isso se deve em grande parte ao fato do SYBR Green

exibir um sinal fluorescente muito forte e, portanto facilmente detectável mesmo em baixas

concentrações. Contudo já se mostrou que o mesmo é capaz de inibir a reação de PCR

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além de diminuir a reprodutibilidade da mesma quando comparado a outros fluoróforos

(Gudnason et al., 2007).

A análise da forma da curva gerada pela desnaturação da molécula de DNA usando

o corante SYBR Green é complicada, pois o mesmo é descrito por alterar a temperatura de

desnaturação do DNA e por ser capaz de se redistribuir ao longo da molécula de dupla fita

intacta à medida que as regiões de fita simples de DNA o despreendem (Giglio et al., 2003;

Varga & James, 2006). Tal característica não saturante da molécula em questão, aliado aos

fatores supracitados, proporcionaram o surgimento de corantes alternativos, sendo muitos

deles para uso específico na técnica de HRM. Dentre as várias moléculas atualmente

disponíveis para o uso em HRM-PCR, destacam-se os corantes da família Syto (Gudnason

et al., 2007). Tais corantes são mais hidrofóbicos do que a grande maioria dos demais

fluoróforos existentes no mercado, além de ligarem-se preferencialmente na região do

sulco menor da molécula de dupla fita de DNA. Dentro desta família de corantes existem

variações em relação, ao custo e excitação de cada molécula, na emissão dos espectros, e

na seletividade e afinidade de ligação ao DNA. Os corantes Syto 13 e 16 são considerados

os melhores corantes no que concerne à ausência de inibição da reação de PCR e efeitos na

desnaturação da dupla fita de DNA (Eischeid, 2011). Como mencionado acima o método

de HRM é útil, reproduzível, e vantajoso finaceiramente, acrescentando o valor de 1 (um)

real por reação de PCR (Li et al., 2010). Desde que respeitado suas limitações, a técnica de

HRM pode ser rotineiramente empregada em laboratórios que trabalhem com genotipgem,

especialmente em áreas onde duas ou mais espécies do coexistam.

No presente trabalho a análise do fragmento de 444 pb do cox1 permitiu a distinção

entre seis espécies do gênero Echinococcus, E. granulosus, E. ortleppi, E. multilocularis,

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E. canadensis, E. vogeli e E. oligarthra além da espécie T. hydatigena (Santos et al.,

2013). A utilização de uma espécie do gênero Taenia levanta a possibilidade da utilização

do marcador mitocondrial da técnica de HRM para os demais membros da família

Taenidae. Além disso, os resultados levantados abrem possibilidade para o uso da técnica

como ferramenta em estudos de identificação de polimorfismos e como metodologia

alternativa para genotipagem de indivíduos em estudos de genética de população em larga

escala, substituindo assim metodologias como RFLP e SSCP.

Atualmente o artigo apresentado neste trabalho, Santos et al. (2013), possui seis

citações. Safa et al. (2015) usaram uma região do gene cox1 contendo um único

polimorfismo e com sucesso empregaram a técnica de HRM para distinguir as espécies E.

granulosus e E. canadensis (G6 e G7). Os autores Sady et al. (2015), que diferenciaram as

espécies Schistosoma mansoni e Schistosoma haematobium, e Wang et al. (2015), os quais

utilizaram a técnica de HRM para detectar mutações em pacientes com osteogênese

imperfeita, utilizaram a metodologia de HRM como ferramenta diagnóstica. Mais

recentemente Dehgahni et al. (2016) utilizaram o marcador ITS1 e por HRM diferenciaram

quatro espécies distintas de parasitos Taeniideos, T. hydatigena, T. multiceps, T. ovis e E.

granulosus. Em suma a utilização da metodologia de HRM, vinculada ao marcador

mitocondrial cox1, vem permitindo o uso mais racional do material biológico, o que

possibilitou a seleção de amostras com pouco material para a realização, por exemplo, de

experimentos de proteômica em larga escala (Santos et al., 2016a,b).

Neste trabalho utilizamos dois conjuntos distintos de amostras de líquido hidático

do parasito Echinococcus spp., ambos provenientes de cistos pequenos e com baixa

quantidade de material biológico disponível, a fim de analisar possíveis mecanismos

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moleculares envolvidos na infertilidade dos cistos e na adaptação de diferentes espécies ao

hospedeiro bovino. Para tanto utilizamos uma abordagem proteômica, para identificação de

proteínas do parasito e do hospedeiro, constituída do fracionamento das amostras por SCX,

seguido de análise por LC-MS/MS. Todas as amostras utilizadas no presente trabalho

pertenciam a cistos com pouca quantidade de albumina bovina, o que permitiu que as os

experimentos fossem realizados sem a necessidade do uso de técnicas para depleção ou

concentração de proteínas, permitindo a análise semi-quantitativa das amostras.

Dentre os resultados obtidos no presente trabalho destacamos: aumento no

repertório conhecido de proteínas, do parasito Echinococcus spp. e do hospedeiro B.

taurus, presentes no líquido hidático de cistos das espécies E. granulosus e E. ortleppi;

identificação de um novo mecanismo de secreção de proteínas na fase larval de E.

granulosus, envolvendo vesículas extracelulares; indícios da existência de uma ‘corrida

armamentista” entre parasito e hospedeiro coordenada pelas proteínas secretadas no líquido

hidático de Echinococcus spp.; existência de uma grande número de proteínas com função

não identificada ou com prováveis funções alternativas, as quais devem ser alvo de futuros

estudos funcionais; identificação de um conjunto de proteínas presente em cistos férteis

oriundos dos pulmões de bovinos; e a identificação de proteínas encontradas

exclusivamente nas espécies E. granulosus e E. ortleppi.

A disponibilidade de genomas, transcritomas e proteomas vem fornecendo

informações sem precedentes em relação aos parasitos do gênero Echinococcus. Em estudo

recente Wang et al. (2015) identificaram, através da análise in silico do genoma de E.

multilocularis, que 673 proteínas (6,4% do proteoma predito) são possivelmente secretadas

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proteínas do parasito E. granulosus no líquido hidático, mesmo utilizando ferramentas para

depleção de proteínas abundantes do hospedeiro, como albumina (Monteiro et al., 2010;

Aziz et al., 2011). No presente trabalho foi possível identificar um total de 204 proteínas

parasitárias analisando oito frações (resultantes do fracionamento por troca catiônica forte)

de cistos férteis e inférteis, e 842 proteínas analisando 30 frações relativas às espécies E.

granulosus e E. ortleppi.

Com o intuito de diminuir ao máximo as interferências externas, aquelas as quais as

amostras de cistos hidáticos coletadas de bovinos já possuem intrinsicamente, como

origem, alimentação e idade do hospedeiro, decidiu-se coletar somente amostras de cistos

oriundos de pulmão de bovino com volume semelhante e baixa quantidade de albumina.

Após a coleta de mais de 600 amostras de cisto hidático, definiram-se aquelas a serem

utilizadas no presente estudo, diferenciando-se apenas quanto à fertilidade e a espécie do

parasito. Além disso, os experimentos não contaram com nenhum tipo de manipulação

proteica posterior a coleta, como depleção de albumina, o que acabaria prejudicando a

análise qualitativa e quantitativa das proteínas presentes no líquido hidático, devido à

inespecificidade intrínseca apresentada por tal metodologia. Aziz et al. (2011) também

analisaram amostras oriundas de líquido hidático de cistos férteis e inférteis e de distintos

hospedeiros, todas pertencentes a espécie E. granulosus. Suas amostras eram constituídas

de três amostras de cistos férteis de fígado de ovelha, duas amostras de cistos inférteis de

fígado de bovino e três amostras de cistos férteis de fígado de humanos. A comparação

entre as amostras de cistos férteis e inférteis ficou comprometida pois os cistos escolhidos

eram oriundos de diferentes hospedeiros, que pode levar a interpretações errôneas a

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respeito da infertilidade. Apenas a comparação entre cistos de diferentes hospedeiros,

ovelha e humanos, pôde ser realizada com confiabilidade.

No presente trabalho, a partir da análise das proteínas identificadas e por

microscopia eletrônica de transmissão sugerimos a existência de um novo modo de

secreção utilizando vesículas extracelulares (microvesículas e exossomos) tanto pelo

parasito E. granulosus quanto possivelmente pelo hospedeiro B. taurus. A produção e

liberação de vesículas extracelulares é atualmente conhecida como uma característica

universal de organismos tanto procariotos quanto eucariotos. Vesículas secretadas variam

de acordo com sua biogênese, composição e tamanho, sendo divididas em diferentes

grupos de acordo com essas características. Os dois principais grupos de vesículas

extracelulares são os exossomos (<100 nm), que são formados a partir das vesículas

intraluminais dos corpos multivesiculares, e as microvesículas (100 nm – 1 µm), que se

originam na membrana plasmática (Silverman & Reiner, 2011; Deolindo et al., 2013).

Vesículas extracelulares apresentam múltiplas funções biológicas e diversos estudos

indicam que seu conteúdo é destinado à comunicação com outras células ou áreas vizinhas,

sendo liberadas tanto de maneira fisiológica como em resposta a fatores externos

(Deolindo et al., 2013).

Estudos recentes têm demonstrado que vesículas extracelulares possuem papel

fundamental na relação parasito-hospedeiro, atuando na transferência de moléculas

(proteínas, ácidos nucleicos, metabólitos) do parasito para as células do hospedeiro, e

vice-versa (Valadi et al., 2007; Novacki et al., 2015). A liberação de vesículas também é uma

via importante para secreção de proteínas, pois fornece a vantagem da proteção contra

degradação por proteases do hospedeiro e a possibilidade de direcionamento para células

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específicas. Em Leishmania spp., por exemplo, foi descrito que a liberação de exossomos

contendo proteínas imunossupressoras, nas etapas iniciais da infecção, facilita o processo

de invasão de macrófagos (Silverman & Reiner, 2012).

Em helmintos parasitas já foram identificadas vesículas extracelulares em três

espécies da classe Trematoda, Fasciola hepatica, Echinostoma caproni e Dicrocoelium

dendriticum. Marcilla et al. (2012) identificaram vesículas do tipo exossomo no tegumento

e nos produtos de secreção de F. hepatica e E. caproni. Os mesmos autores também

demonstraram que as vesículas de E. caproni são internalizadas por enterócitos em cultura,

tipo celular com a qual o verme tem contato durante a infecção. Em exossomos de D.

dendriticum foram identificados miRNAs com potencial utilização como biomarcadores

para diagnóstico da infecção (Bernal et al., 2014).

A presença de diferentes moléculas de RNA em vesículas extracelulares

parasitárias indica que essa classe de biomoléculas também tem papel importante na

interação parasito-hospedeiro. Em Trypanosoma cruzi foi demonstrado que pequenos

RNAs derivados de tRNA são transferidos para células de mamíferos suscetíveis

(Garcia-Silva et al., 2014a,b). Os pequenos RNAs e mRNAs transferidos, via vesículas, para as

células do hospedeiro atuam regulando a produção de proteínas e a expressão gênica do

hospedeiro em favor do parasito (Valadi et al., 2007). Surpreendentemente, em Leishmania

spp. e F. hepatica observou-se que as proteínas contidas nas vesículas secretadas

correspondiam a mais da metade do total de proteínas secretadas, incluindo proteínas que

não possuem sequência sinal conhecida de secreção, explicando assim a localização

extracelular de tais proteínas (Marcilla et al., 2012; Silverman et al., 2010).

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A contrapartida também é valida, pois recentemente muitos trabalhos têm

observado como hospedeiros reagem à infecção ou contato com outros organismos

incluindo parasitos por meio da liberação de vesículas extracelulares e exossomos

(Ramachandra et al., 2015; Schorey et al., 2015). Baseados nos dados aqui descritos nós

hipotetizamos que as vesículas extracelulares encontradas no líquido hidático de cistos

inférteis provêm do hospedeiro e que as mesmas poderiam ser aqui explicadas, por terem

duas origens distintas, contudo não exludentes.

Internamente o cisto hidático é recoberto pela camada germinativa a qual produz os

protoescólices, e que possui como barreira protetora as células e/ou matriz extracelular do

hospedeiro a camada laminar, uma capa acelular rica em carboidratos secretada pela

prórpia camada germinativa (Díaz et al., 2011a). A camada laminar possui uma espessura

de aproximadamente 3 mm na espécie E. granulosus (Bortoletti & Ferreti, 1978), sendo

considerada uma matriz extracelular especializada encontrada unicamente em parasitos do

gênero Echinococcus, e evolutivamente designada a manter a integridade física do

metacestódeo e proteger a camada germinativa da resposta imune gerada pelo hospedeiro.

Rupturas no cisto hidático durante seu estabelecimento e manutenção nos órgãos do

hospedeiro ocorrem com frequência e é justamente a camada laminar que dificulta e muitas

vezes impede a entrada de células e moléculas do hospedeiro através de microfissuras

causadas pela pressão externa (Brunetti et al., 2010). Embora a camada laminar seja

elástica, o crescimento do cisto hidático em até seis ordens de grandeza não pode ser

suportado apenas pela característica elasticidade; e, por conseguinte acredita-se que o

afrouxamento mecânico e/ou químico da estrutura laminar da camada laminar deva ocorrer

(Díaz et al., 2011a). Tal afrouxamento acrescido ao fato da camada laminar permitir a

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passagem de nutrientes e algumas proteínas, a caracterizam como uma malha elástica,

hidrofílica, a qual permite a difusão de macromoléculas de até 150 kDa (Coltorii &

Varela-Díaz, 1974; Díaz et al., 2011b). Sendo assim, a primeira possível origem para a existência

de vesículas extracelulares de B. taurus dentro dos cistos é a de que tais partículas e

mesmo proteínas isoladas ou em complexos proteicos teriam a capacidade de transpassar a

camada laminar, durante o crescimento do cisto, ou através de difusão através da malha

laminar.

Conhecidamente, neutrófilos estão na linha de frente da defesa inata contra

bactérias, atuam principalmente por fagocitose e digestão de bactérias invasoras. Entre as

respostas recentemente descritas para neutrófilos estão as NETs, nas quais há liberação de

DNA do neutrófilo associado a proteínas antimicrobianas (Brinkmann et al., 2004). Os

neutrófilos encontrados no sangue humano também são capazes de controlar o crescimento

bacteriano através da liberação de vesículas extracelulares (Timár et al., 2013). Os mesmos

autores mostraram que vesículas extracelulares produzidas por neutrófilos encontrados no

sangue humano têm tamanho e composição proteica própria quando os mesmos são

estimulados pela presença de bactérias. Como resultado, tais autores verificaram que

vesículas extracelulares possuem efeito bacteriostático, atuando na redução do crescimento

e locomoção bacterianos. Além do efeito bacteriostático, existem indícios de que a

secreção de vesículas extracelulares por neutrófilos tenha efeito antibacteriano,

aumentando ainda mais a complexidade e diversidade de resposta à presença de bactérias

promovida por neutrófilos. Neutrófilos são conhecidos por interagirem com parasitos

invasores e por desempenharem papel fundamental na defesa do hospedeiro durante o

estabelecimento de tais organismos (Falcone et al., 2001). Interessantemente, neutrófilos já

156

foram encontrados no líquido hidático de cistos hidáticos coletados de humanos (Zhang et

al., 2003), além disso já foi demonstrado in vitro que neutrófilos em associação com

anticorpos levam a morte da oncosfera e protoescólices de E. granulosus (Riley et al.,

1986; Rogan et al., 1992). Uma segunda origem para a existência de vesículas

extracelulares do B. taurus dentro do cisto hidático seria através da entrada de neutrófilos

no cisto, os quais secretariam tais vesículas.

O líquido hidático de E. granulosus contém uma mistura complexa de produtos de

excreção/secreção oriundos da camada germinativa, dos protoescólices, além de proteínas

do hospedeiro, indicando uma intensa comunicação parasito-hospedeiro, na qual vesículas

extracelulares poderiam ter um papel central (Santos et al., 2016a). Trabalhos anteriores

identificaram no líquido hidático e no sobrenadante de cultivo in vitro de protoescólices

diversas proteínas que não apresentam sinal para exportação (Lorenzatto et al., 2012;

Monteiro et al., 2010; Virginio et al., 2012), mas que já foram descritas em outros

parasitos sendo secretadas por meio de vesículas, como por exemplo as proteínas aldolase,

enolase e histonas. A produção de vesículas extracelulares e o seu conteúdo pode estar

relacionado com a capacidade de estabelecimento e sobrevivência do cisto hidático através

da atuação em processos básicos de evasão da resposta imune e captação de nutrientes. A

caracterização das vesículas extracelulares poderá ajudar a identificar mecanismos

moleculares que possam diferenciar espécies muito similares morfologicamente, mas com

diferenças nas taxas de desenvolvimento, patogenicidade e especificidade pelo hospedeiro.

Uma proporção grande das proteínas identificadas tanto do parasito quanto do

hospedeiro foi caracterizada como peptidases e inibidores de peptidase, o que já foi

relatado para outros helmintos, inclusive para a espécie T. solium (Gomez et al., 2015). As

No documento Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Centro de Biotecnologia. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular (páginas 146-162)