127
Apesar da existência de métodos de prevenção primária ao câncer cervical, através da vacinação contra a infecção pelo HPV, e prevenção secundária pelo exame de Papanicolaou, para detectar lesões pré-cancerosas da cérvice uterina, o câncer cervical ainda é uma importante patologia que acomete um elevado número de mulheres no mundo todo (El-zein et al., 2016). Então acreditamos que ainda se faz necessária a busca de novas técnicas que auxiliem no diagnóstico e tratamento desta doença.
A DPPIV/CD26 é uma proteína multifuncional que vem sendo amplamente estudada em diferentes tipos tumorais. O interesse no estudo desta proteína se deve às suas diferentes funções que se correlacionam com importantes processos biológicos implicados no câncer. Onde podemos destacar sua capacidade de clivar e modular a atividade de diferentes peptídeos biológicos (Cordero et al., 2009), sua ação como proteína responsável por ancorar a ADA à superfície celular facilitando a degradação da adenosina (Dong et al., 1997), sua ligação à proteínas da matriz extracelular (Cheng et al., 2003) e sua interação com diferentes vias regulando proteínas relacionadas à tumorigênese (Havre et al., 2008; Beckenkamp et al., 2016).
Considerando que não existiam pesquisas relacionando o câncer de colo de útero com a DPPIV/CD26, nosso objetivo inicial foi determinar a expressão e atividade desta proteína em células de câncer cervical, em comparação com queratinócitos imortalizados. Para este estudo foram utilizadas linhagens de câncer cervical SiHa (contém cópias do HPV 16 incorporado ao seu genoma), HeLa (contém cópias do HPV 18 incorporado ao seu genoma) e C33A (não contém cópias do HPV), além disso como controle não tumoral foi utilizada a linhagem de queratinócitos imortalizados, HaCaT.
Inicialmente avaliamos a atividade enzimática da DPPIV/CD26 em células aderentes utilizando o substrato artificial Gli-Pro-p-nitroanilida. Observamos a formação de p-nitroanilina in vitro para todas as linhagens estudadas, indicando que estas células apresentam atividade enzimática dipeptidilpeptidásica, a qual se mostrou linear dentro de um período de incubação de 2 horas.
128
Tendo em vista a existência de outras enzimas com atividade semelhante a da DPPIV/CD26, avaliamos se a atividade determinada era realmente atribuída à ação desta enzima, através do uso de inibidores e diferentes condições de reação. Sabe-se que FAP apresenta baixa afinidade pelo substrato Gli-Pro-p-nitroanilida. DPP8 e DPP9 são enzimas citoplasmáticas e não existem evidências de que sejam secretadas. Por outro lado, sabe-se que a DPP2 pode ser secretada para o meio extracelular (Gorrell et al., 2005). Para excluir a atividade de DPP8 e DPP9 utilizamos o inibidor enzimático N-Etilmaleimida (NEM), e para eliminar a ação da DPP2, que é ativa em pH ácido, utilizamos tampão TE com pH=8 (Yu et al., 2009). Ainda utilizamos o inibidor da DPPIV/CD26, fosfato de sitagliptina. Assim, padronizamos a determinação específica da atividade da DPPIV/CD26 em monocamada de células, que pode ser determinada em temperatura ambiente e pH=8, tendo em vista que em pH= 7,4 a 37oC, parece haver uma ação conjunta da DPPIV/CD26 e DPP2. DPP8 e DPP9 não demonstraram atividade enzimática em células íntegras em monocamada. As células de câncer cervical demonstraram atividades enzimáticas inferiores à linhagem não tumoral (HaCaT). Mas em geral a atividade da DPPIV/CD26 nestas células pode ser considerada baixa.
Considerando a existência da forma solúvel desta enzima, avaliamos a atividade enzimática no sobrenadante após 1 hora de contato do meio com as células aderentes. Foi observada atividade da sDPPIV/sCD26 no sobrenadante de todas as linhagens. Assim, foi demonstrada uma importante atividade da sDPPIV/sCD26 após um curto período de liberação desta enzima para o sobrenadante da cultura celular. A sDPPIV/sCD26 representa atualmente um promissor biomarcador para diferentes tipos de câncer (Cordero et al., 2011). Estudos preliminares do nosso grupo de pesquisa apontam para uma atividade reduzida da sDPPIV/sCD26 no plasma de pacientes com câncer cervical, quando comparado com indivíduos saudáveis (Borowicz et al., dados não publicados).
A fim de avaliar o perfil de expressão da DPPIV/CD26 entre as diferentes linhagens celulares foram realizadas as técnicas de real time PCR e citometria de fluxo. Verificou-se uma baixa expressão de DPPIV/CD26 nas
129
linhagens celulares estudadas, sendo que entre estas, as linhagens HaCaT e SiHa apresentaram maior expressão de DPPIV/CD26, seguidas da C33A e na linhagem HeLa esta expressão foi praticamente indetectável, tanto à nível de RNAm quanto de proteína. Os níveis de expressão da DPPIV/CD26 se correlacionaram com a atividade enzimática observada nestas células.
Sendo assim, nesse estudo caracterizamos pela primeira vez os níveis de expressão e atividade da DPPIV/CD26 em linhagens celulares de câncer cervical, em comparação a linhagem de queratinócitos imortalizados (Beckenkamp et al., 2015). Recentemente Liu e colaboradores demonstraram que a DPPIV/CD26 é expressa em baixos níveis e encontra-se hipermetilada em amostras de pacientes com câncer cervical (Liu et al., 2016).
Tendo em vista a baixa expressão de DPPIV/CD26 em linhagens celulares (Beckenkamp et al., 2016) e pacientes com câncer cervical (Liu et al., 2016), e que a infecção pelo HPV é um fator determinante para o desenvolvimento deste tipo tumoral, nosso próximo objetivo foi avaliar se existe alguma relação entre a expressão de DPPIV/CD26 e a expressão das oncoproteínas E6 e E7 do HPV.
O HPV é considerado como um agente etiológico do câncer cervical. Porém, sabe-se que a infecção pelo HPV é um fator necessário, mas não suficiente, para o desenvolvimento deste tipo de câncer (zur Hausen et al., 2009). Os genótipos de HPV são classificados como de alto ou baixo risco, de acordo com seu potencial oncogênico. A infecção persistente por HPV de alto risco, com integração do DNA viral ao genoma do hospedeiro, leva a uma superexpressão das oncoproteínas E6 e E7, as quais são as principais responsáveis pela transformação celular (McLaughlin-Drubin et al., 2009).
A oncoproteína E6 leva à degradação e inativação do produto do gene supressor de tumor p53, via ligação à E6AP, inibindo a apoptose, e E7 inibe a proteína do retinoblastoma (pRb), a qual inibe a progressão do ciclo celular (Dyson et al., 1989; Werness et al., 1990). Desta forma, ocorre a inibição da atividade pró-apoptótica e a progressão do ciclo celular, e as células com DNA danificado podem replicar.
130
Nosso estudo demonstrou que queratinócitos expressando a oncoproteína E6 de HPV de alto risco apresentam uma expressão reduzida de DPPIV/CD26, à nível de RNAm e proteína, quando comparados com queratinócitos controle (transduzidos com o vetor vazio). Por outro lado, a expressão da oncoproteína E7 não apresentou efeito sobre os níveis de DPPIV/CD26.
Apesar de todos os tipos de HPV possuírem genes E6 e E7 homólogos, estes não são idênticos. Assim, as proteínas virais E6 e E7 de HPVs de baixo risco possuem baixa afinidade de ligação à p53 e pRb, respectivamente. Desta forma E6 não é capaz de degradar p53, e E7 não induz a desestabilização de pRb (Gage et al., 1990; Werness et al., 1990; Munger et al., 2004). Os HPVs de baixo risco causam lesões benignas, como condilomas (verrugas), que afetam a região anogenital.
Tendo em vista a relação observada entre a DPPIV/CD26 e a oncoproteína E6, e sabendo que esta atua principalmente via degradação de p53, investigamos o envolvimento desta via na regulação da expressão de DPPIV/CD26. Para isto utilizamos queratinócitos expressando as oncoproteínas de HPV de baixo risco, que como descrito acima, apresentam baixa afinidade de ligação à p53 e pRb (Guess e McCance 2005). E também utilizamos uma forma mutada de E6 de HPV de alto risco caracterizada pela deleção de cinco aminoácidos (Δ118-122) no segundo dedo de zinco. Esta alteração em uma região funcionalmente importante confere a perda da capacidade de ligação e degradação de p53 (Foster et al., 1994).
Foi possível observar que queratinócitos transduzidos tanto com a oncoproteína E6 de HPV de baixo risco, quanto com a E6 mutada, não apresentaram alteração na expressão de DPPIV/CD26. Sendo assim, podemos inferir que a degradação da p53 pela E6 é um processo necessário para a regulação negativa da DPPIV/CD26 nestas células. Até o momento nenhum estudo havia descrito a relação entre a DPPIV/CD26 e p53. Neste trabalho pudemos observar uma correlação positiva entre estas duas proteínas relacionadas à carcinogênese.
131
Ainda avaliamos a expressão de DPPIV/CD26 em um modelo de cultura organotípica, onde a proliferação e diferenciação celular ocorrem de uma forma muito semelhante àquela que acontece no epitélio escamoso, constituindo uma ferramenta muito interessante para o estudo da carcinogênese. Observamos que culturas organotípicas de queratinócitos expressando as oncoproteínas E6E7 de HPV de alto risco apresentam reduzida expressão de DPPIV/CD26. Nestas culturas também foi possível observar alterações celulares como coilocitose, figuras de mitose e padrão alterado de diferenciação do epitélio, que são também características de neoplasias intraepiteliais cervicais observadas in vivo.
Desta forma, estes resultados indicam que a oncoproteína E6 de HPV de alto risco regula negativamente a expressão de DPPIV/CD26, por uma via dependente da degradação de p53. Este achado pode explicar, ao menos em parte, a baixa expressão de DPPIV/CD26 encontrada em pacientes e células de câncer cervical, tendo em vista a importância da infecção pelo HPV e expressão de suas oncoproteínas para o desenvolvimento deste tipo tumoral.
Apesar destes estudos demonstrarem a baixa expressão de DPPIV/CD26 no câncer cervical, até o momento o papel desta proteína ainda não foi investigado neste tipo de câncer. Sendo assim, nosso próximo objetivo foi induzir a expressão de DPPIV/CD26 em células de câncer cervical para posterior avaliação dos efeitos desta proteína. Para isto construímos plasmídeos contendo a sequência codificante da DPPIV/CD26, tanto em sua forma íntegra (wt) quanto na forma mutada (mut), induzida pela substituição do resíduo de serina na posição 630 por alanina.
Para a construção do plasmídeo foi utilizado um vetor lentiviral apropriado para transdução gênica (pLR2). O pLR2 contém a sequência da proteína verde fluorescente (GFP) como gene repórter (Vargas et al., 2012). A inserção da sequência da DPPIV/CD26 ao pLR2 foi confirmada através da clivagem dos plasmídeos com enzimas de restrição e por sequenciamento de DNA. Neste último ensaio também foi possível confirmar a mutação S630A no plasmídeo pLR2CD26mut.
132
Células da linhagem HeLa, a qual apresentou níveis quase indetectáveis de DPPIV/CD26, foram transfectadas com os plasmídeos construídos. Após transfecção foi possível observar células GFP+, confirmando a eficiência do processo. O pico de expressão foi determinado e demonstrou ocorrer após 48 horas do momento da transfecção. A expressão da DPPIV/CD26 à nível de RNAm foi confirmada por RT-PCR e sua expressão na superfície celular foi verificada por citometria de fluxo. Além disso, as células transfectadas com pLR2CD26wt apresentaram um aumento significativo na atividade enzimática desta proteína, o que não foi observado em células transfectadas com pLR2CD26mut, confirmando o efeito da mutação S630A da DPPIV/CD26. Sendo assim, confirmamos a funcionalidade dos plasmídeos construídos.
A indução da expressão de DPPIV/CD26 de forma estável, realizada por transdução gênica empregando o uso de lentivírus não foi alcançada com êxito devido à baixa eficiência de transdução (provavelmente devido à dificuldade de empacotamento dos plasmídeos, tendo em vista seu tamanho de 10.496pb). Além disso, mesmo após a purificação das células transduzidas, por sorting, ainda foi observada uma população mista, contendo células GFP+ e GFP-. Ao longo da expansão destas células foi observada uma redução do percentual GFP+, o que pode ser devido à redução na proliferação celular causada pela DPPIV/CD26 (dados não mostrados).
Inicialmente observamos que células HeLa transfectadas com a sequência da DPPIV/CD26 apresentavam um reduzido crescimento celular quando comparadas com células controle transfectadas com o vetor vazio (pLR2). Além da redução na contagem de células expressando DPPIV/CD26, observamos uma dificuldade na formação de novos clones e uma menor expressão do marcador de proliferação celular, Ki67, nestas células.
Da mesma forma, um estudo utilizando células de carcinoma endometrial com expressão induzida de DPPIV/CD26 demonstrou uma redução na taxa de proliferação, acompanhada pela diminuição nos níveis de SDF-1, indicando a importância da atividade catalítica da DPPIV/CD26 no processo de proliferação celular (Mizokami et al., 2004). Porém, tendo em vista que nos nossos experimentos utilizando células expressando a forma mutada
133
da DPPIV/CD26 (S630A) desprovida de atividade serina protease também encontramos uma redução na proliferação celular, acreditamos que mecanismos não proteolíticos devem contribuir para este efeito da DPPIV/CD26. De acordo com este achado, em diferentes estudos a expressão da forma mutada da DPPIV/CD26 demonstrou resultados semelhantes aos encontrados quando a expressão de DPPIV/CD26 “wild-type” foi induzida (Wesley et al., 2004; Busek et al., 2012).
Tendo em vista que estudos demonstram que a expressão da DPPIV/CD26 está relacionada com o processo de migração celular (Kajiyama et al., 2002; Wesley et al., 2005; Arscott et al., 2009; Busek et al., 2012), inicialmente avaliamos este parâmetro nas linhagens SiHa e HeLa, as quais apresentaram maior e menor expressão desta enzima, respectivamente, dentre as linhagens de câncer cervical estudadas (capítulo 2). Pelo ensaio de Wound- healing pudemos observar um aumento significativo da migração celular na linhagem SiHa na presença do inibidor específico da DPPIV/CD26 (fosfato de sitagliptina). Estes dados nos permitiram inferir que a migração celular nesta linhagem é ao menos em parte influenciada pela atividade da DPPIV/CD26 (Beckenkamp et al., 2015).
A migração e invasão celular são facilitadas por quimiocinas, como o SDF-1, substrato que é clivado e inativado pela DPPIV/CD26. Um estudo com células de neuroblastoma demonstrou uma redução significativa no potencial de migração quando foi induzido um aumento na expressão da DPPIV/CD26. E este efeito foi revertido quando utilizado um inibidor desta enzima, indicando a relação da atividade enzimática da DPPIV/CD26 sobre este mecanismo (Arscott et al., 2009), corroborando os resultados encontrados no nosso estudo para a linhagem SiHa. Além disso, células de neuroblastoma com expressão induzida de DPPIV/CD26 apresentaram redução dos níveis de SDF-1 e na expressão do receptor CXCR4 (Arscott et al., 2009).
Porém, avaliando a migração em células HeLa com expressão induzida de DPPIV/CD26 não encontramos modificações neste parâmetro celular em comparação com o controle transfectado com o vetor vazio (pLR2). Sendo assim, na linhagem HeLa a expressão da DPPIV/CD26 não parece estar
134
relacionada com a migração celular (capítulo 4). Porém, uma limitação deste ensaio foi a baixa taxa de migração observada em todas as células transfectadas durante o período avaliado. Além disso, observamos que esta linhagem celular não expressa SDF-1. Isto pode justificar o fato desta proteína não influenciar na migração celular, pois o substrato não está disponível no meio celular. Porém, apesar de células HeLa não expressarem SDF-1, elas apresentam elevada expressão gênica do receptor CXCR4, a qual não foi afetada pela indução na expressão de DPPIV/CD26. Um estudo demonstrou que a adição exógena de SDF-1 em células HeLa levou a um aumento na migração celular (Dillenburg-Pilla et al., 2015). Sendo assim, o ideal seria realizar o ensaio de migração celular na presença deste substrato, a fim de confirmar a importância da DPPIV/CD26 na migração celular.
A DPPIV/CD26 também está envolvida na transição epitelial- mesenquimal, regulando a expressão de marcadores como E-caderina, N- caderina, slug, twist e vimentina, além de metaloproteinases (MMPs), que se relacionam à invasão tumoral (Kajiyama et al., 2003; Pang et al., 2010; Beckenkamp et al., 2016). Ao avaliar a expressão gênica de marcadores de transição epitelial-mesenquimal, E-caderina e N-caderina, em células expressando DPPIV/CD26 não foi observada diferença significativa quando comparado com células não transfectadas e transfectadas com o vetor vazio. Além disso, destacamos que células HeLa apresentam uma expressão muito baixa de E-caderina e uma maior expressão de N-caderina, indicando características mesenquimais. Ainda avaliamos a expressão de MMP2 e MMP9, onde também não encontramos diferença significativa em relação à expressão de DPPIV/CD26. Notamos que células HeLa apresentam expressão de MMP2, porém não expressam MMP9.
Foi demonstrado que um dos principais mecanismos pelo qual a DPPIV/CD26 regula o processo neoplásico está envolvido com sua modulação sobre a expressão de diversas proteínas relacionadas à adesão celular, como E-caderina, β-catenina, integrina β1, versican, periostina e CD44. Além disso, a DPPIV/CD26 interage com proteínas da matriz extracelular, como colágeno e fibronectina, apresentando relação com a adesão celular (Cheng et al., 2003).
135
Avaliando a adesão de células das linhagens SiHa e HeLa observamos uma diminuição significativa deste processo quando foram incubadas na presença do inibidor seletivo da DPPIV/CD26 (capítulo 2). Porém, como a linhagem HeLa apresenta baixa atividade e expressão desta proteína e também teve a adesão reduzida na presença do inibidor, estes achados sugerem que o fosfato de sitagliptina afeta a adesão por algum mecanismo independente da DPPIV/CD26. Sendo assim, também não se descarta a possibilidade de o efeito do fosfato de sitagliptina sobre a migração celular na linhagem SiHa ser independente desta proteína. Além disso, células HeLa transfectadas com a sequência da DPPIV/CD26 não apresentaram diferença na adesão celular, nem ao plástico, e nem à matrizes extracelulares (colágeno e fibronectina) em relação à células transfectadas com o vetor vazio (capítulo 4).
Entre as funções da DPPIV/CD26 também se destaca o seu papel como a principal proteína responsável por ancorar a ADA à superfície celular, facilitando o metabolismo da adenosina a inosina (Dong et al., 1997). Em determinados tipos de câncer é observada baixa expressão de DPPIV/CD26, com consequente redução na atividade da ADA (Lefort et al., 2011). Assim, a adenosina acumula e atua favorecendo a angiogênese, estimulando a motilidade e crescimento celular, suprimindo o sistema imunológico e facilitando a sobrevivência de tumores (Mujoomdar et al., 2004; Tan et al., 2004). Além disso, foi descrito que a adenosina regula negativamente a expressão de DPPIV/CD26 em células de câncer colorretal, desta forma ocorre uma redução na atividade intrínseca da DPPIV/CD26, na ligação à ADA e na interação com proteínas da matriz extracelular, facilitando ainda mais os efeitos da adenosina e de quimiocinas que acumulam no microambiente tumoral (Tan et al., 2004).
Neste estudo demonstramos que células HeLa com expressão induzida de DPPIV/CD26 apresentaram um aumento estatisticamente significativo na expressão e atividade de ADA. Apesar de a expressão e atividade quase duplicar nestas células, este efeito não deve ser considerado significante biológicamente, pois a expressão e atividade desta proteína nesta linhagem são praticamente indetectáveis, permanecendo em níveis muito baixos mesmo
136
após a expressão de DPPIV/CD26. Mas este achado indica uma correlação positiva entre a DPPIV/CD26 e ADA, corroborando os achados descritos em células de câncer colorretal (Tan et al., 2004).
A DPPIV/CD26 é uma proteína multifuncional, que pode atuar como um supressor tumoral ou como um marcador de agressividade, dependendo da localização do tumor, do tipo celular e do microambiente tumoral. Nossos resultados indicam uma redução na expressão da DPPIV/CD26 durante a progressão do câncer cervical, a qual parece estar relacionada à expressão da oncoproteína E6 de HPV de alto risco, e à degradação de p53. Além disso, este estudo apresenta evidências que apontam para o papel da DPPIV/CD26 como um supressor tumoral no câncer cervical, levando a uma redução no crescimento celular. Sendo assim, acreditamos que esta proteína possa vir a se tornar um biomarcador e um possível alvo terapêutico para o câncer cervical.
137