Os resultados do padrão das amilases digestivas, através de eletroforese e ensaios em gel, revelaram que Z. subfasciatus não transmite o padrão de indução das duas isoformas de -amilase de baixa migração eletroforética para uma futura geração (Fig. 5). Intestinos das larvas de insetos oriundos de P. vulgaris, onde há a presença do αAI-1, apresentaram a indução das duas isoformas induzidas de α-amilase, enquanto que os animais oriundos das sementes de V. unguiculata, onde o AI-1 é ausente, apresentaram somente um nível de expressão basal dessas isoformas, o que corrobora com os resultados obtidos em estudos anteriores (SILVA et
al., 2001b; BIFANO et al., 2010). No entanto, a passagem de somente
uma geração no interior de sementes de P. vulgaris não demonstrou ser suficiente para possibilitar que uma parental passe a transmitir o padrão de indução das amilases digestivas para a sua prole que passa a se desenvolver no interior de sementes de V. unguiculata (Fig. 5).
Para passagem do padrão das duas isoformas de -amilase para futuras gerações, por mecanismos de herança epigenéticos, deve haver uma modificação ou uma continuidade de indução nas células germinativas e eventualmente nos gametas. Essas variações precisam sobreviver a processos de gametogênese e aos primeiros estágios da embriogênese, que são etapas onde há reconstruções das células e da cromatina (reprogramação celular), sendo passos importantes para o futuro desenvolvimento do embrião (JABLONKA, 2013; JABLONKA; LAMB, 2015). Portanto, nossos resultados indicam que caso esteja havendo algum tipo de modificação epigenética, promovida por uma parental que teve um ciclo de vida no interior de sementes de P. vulgaris, elas não tenham sido resistentes o suficiente para ultrapassar estas barreiras. Portanto, seus estados epigenéticos e sua continuidade de indução das duas isoformas de -amilase não foram reconstruídas (Fig. 5).
Esses resultados não descartam a possibilidade de que mecanismos epigenéticos possam estar atuando, porém, de uma maneira somente somática (somente no indivíduo). Já foi demonstrado que Z. subfasciatus quando em contato com o AI-1
promove uma expressão constitutiva e irreversível das duas isoformas de -amilase (BIFANO et al., 2010). Quando larvas desses insetos, com doze dias de idade, são removidos de sementes de P.
vulgaris e transferidos para capsulas de gelatina contendo farinha dos
grãos de V. unguiculata, eles permanecem com a alta expressão das amilases induzidas até completar dezessete dias de vida, que é o estágio onde a alimentação é cessada (BIFANO et al., 2010). Portanto, essa indução permanece altamente expressa, mesmo o inseto passando por instares larvais. O crescimento animal culmina com o surgimento de um número maior de células, inclusive, que nunca tiveram o contato com o AI-1. Isso mostra um forte indício de que mecanismos epigenéticos possam estar atuando para que a expressão dos genes, responsáveis por essa indução, permaneçam sendo altamente expressos e que essa informação seja passada para novas células recém-formadas. Nesse mesmo trabalho, foi demonstrado que as células do intestino de Z. subfasciatus promove a clivagem do AI-1. Preparações de microvilosidades das larvas de
Z. subfasciatus são capazes de promover hidrólise do AI-1(BIFANO
et al., 2010). Ishimoto e Chrispeels, (1996), já tinham demonstrado
este evento de hidrólise do AI-1 e a liberação de um peptídeo C- terminal, sendo uma proteinase do tipo serínica envolvida neste processo. A hipótese levantada por este trabalho, é que o peptídeo liberado por esta hidrólise funcione como um peptídeo sinal, que quando em contato com a célula, promove uma cascata de sinalização, ocasionando o acionamento de mecanismos epigenéticos atuarem para a expressão constitutiva e irreversível dessas duas isoformas de -amilase.
Importante ressaltar, que há pouca informação na literatura em relação aos mecanismos epigenéticos encontrados em insetos, principalmente referentes a Z. subfasciatus. Um dos sistemas epigenéticos mais estudados é a metilação do DNA, que são marcações em nucleotídeos de citosina (CpG) que promovem alterações da cromatina, estando geralmente relacionados a silenciamentos gênicos. Muitos estudos envolvendo este mecanismo vieram de experimentos envolvendo mamíferos e plantas, sendo em insetos algo relativamente novo (GALASTAD; HUNT; GOODISMAN, 2014). Porém, várias espécies de insetos possuem estes mecanismos em seus genomas (GALASTAD; HUNT; GOODISMAN, 2014). Já espécies como Drosophila melanogaster e Tribolium
castaneum, não foram encontrados níveis significativos de
nucleotídeos metilados, o que mostra grande variação do papel da metilação de DNA na biologia das diferentes espécies de insetos
(URIELI-SHOVAL et al., 1992; GOWHER; LEISMANN; JELTSCH, 2000; TRIBOLIUM GENOME SEQUENCING CONSORTIUM GALASTAD, 2008; HUNT; GOODISMAN, 2014). O conhecimento de quais são os instrumentos epigenéticos que estão presentes em Z.
subfasciatus e como eles influenciam seus sistemas de expressões
gênicas ainda são desconhecidos. Essas informações podem ser importantes para a investigação do papel do αAI-1 como possível indutor de modificações epigenéticas.
Os perfis de atividade de amilases também mostraram indiferença em ter uma parental vinda de P. vulgaris, sendo que ao voltar a se desenvolver no interior de grãos de V. unguiculata o padrão de Z. subfasciatus nestas sementes volta a se restabelecer (Fig. 6). Embora as amostras não tenham se diferenciado estatíticamentos, as atividades mostraram ser discrepantes, insetos oriundos de P. vulgaris com menores valores quando comparados aos insetos oriundos de V. unguiculata. Bifano e colaboradores (2010) mediram a atividade de -amilase de larvas de Z. subfasciatus em diferentes dias após a sua infestação (12-17 dias), em sementes de V. unguiculata e P. vulgaris, e notaram que os padrões de atividade apresentam diferenças de acordo com os dias do qual as larvas são retiradas dos grãos. Os diferentes dias de coleta das larvas de 4º instar (15 dias em V. unguiculata e 18 dias em P. vulgaris - item 3.6) pode estar relacionado a esta grande diferença das atividades de amilases. Provavelmente, 18 dias de desenvolvimento em P. vulgaris as larvas estejam mais próximas do estágio pupa, sendo assim, pode já ter iniciado uma suspensão da expressão de suas enzimas digestivas. Enquanto que 15 dias de desenvolvimento em V.
unguiculata as larvas devem ter uma expressão maior das suas
enzimas digestivas por estarem mais distantes deste estágio. Amostras intestinais das larvas de Z. subfasciatus oriundas de P. vulgaris mostraram menores valores de atividade de -amilase
in vitro, porém, em gel SDS-PAGE notamos haver uma maior ou
semelhante atividade quando comparamos com os insetos oriundos de V. unguiculata (Fig. 5 e 6). Isso pode estar relacionado com a própria técnica eletroforética adotada. Michaud e colaboradores (1996), constataram que os complexos formados entre protease cisteínica e diferentes cistatinas (seu inibidor), quando submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE, são diferentemente dissociados e podem mostrar atividades em gel pós eletroforese. Isso
sugere que algo similar possa estar ocorrendo em nosso experimento. Os A-1, presentes nas amostras oriundas de P.
vulgaris, podem estar sofrendo desacoplamentos com as -amilases,
que agora livres da ligação com o seu inibidor, podem estar retornando suas atividades enzimáticas, mostrando uma maior atividade que o esperado em gel. No mesmo trabalho, Michaud e colaboradores (1996) mostraram que a relação de dissociação é inversamente proporcional à afinidade entre as moléculas, quando as proteases cisteínicas foram submetidas a inibidores cistanina A (HSA) e cistatina B (HSB) (Ki 1.9 X 10-11 M e 1.2 X 10-10 M,
respectivamente) não mostraram atividade em gel, enquanto que, submetidas a Inibidores de protease cisteína 1 (OC1) e protease cisteína 2 (OC2) (Ki 3.6 X 10-8 M e 1.1 X 10-6 M, respectivamente) a
atividade foi constatada. O que faz da técnica de eletroforese em gel SDS-PAGE como um parâmetro útil para medir afinidade entre moléculas. Caso o que foi mencionado anteriormente estiver ocorrendo, supõe-se que o modo com que se liga o A-1 de P.
vulgaris com a -amilases de Z. subfasciatus seja de uma maneira
reversível e com uma afinidade relativamente baixa.
A análise da colaboração maternal e/ou paternal surgiu a partir do estudo envolvendo camundongos submetidos a estresses traumáticos, no caso uma separação maternal. Estes indivíduos, quando submetidos neste tratamento, apresentaram mudanças comportamentais e metabólicas que se perpetuaram para gerações seguintes, mesmo na ausência do estímulo traumatizante. Essa herança foi atribuída a expressão de pequenos RNAs não codificantes (sncRNAs) presentes nos espermatozoides de camundongos machos, portanto, uma colaboração paternal para esta perpetuação fenotípica (GAPP et al., 2014). O estresse aqui testado seria o contato das larvas de Z. subfasciatus com o αAI-1. Para averiguar como funcionaria uma possível colaboração parental para a transmissão da herança da expressão constitutiva das duas isoformas de -amilase, foram realizados os diferentes cruzamentos entre indivíduos virgens oriundos de P. vulgaris e V. unguiculata (item 3.3). Nossos resultados mostraram ser inconclusivos em identificar a contribuição maternal e/ou paternal da expressão das duas isoformas induzidas de -amilase para uma geração que passa a se desenvolver no interior de grãos de V. unguiculata (Fig. 7). Ambos os cruzamentos, entre fêmeas e machos oriundos de P. vulgaris e somente machos oriundos de P. vulgaris, parecem ter demostrando uma maior expressão das duas amilases induzidas, como os machos vindos de P. vulgaris estão envolvidos nessas duas amostras, isso
sugere que ele tenha uma maior colaboração para isso (Fig. 7). No entanto, o gel não demonstrou claras resoluções do padrão de amilases, além de não constar de uma amostra controle de indução positiva e negativa das duas isoformas de -amilase, como na Figura 5 e 6 (raiais Pc e Vc respectivamente). Isso mostra a necessidade de repetição do experimento para maiores conclusões.
As larvas do experimento da colaboração maternal e/ou paternal foram retiradas de grãos de V. unguiculata no mesmo período de tempo (15 dias), portanto, não possui a variável de dias que é presente no experimento anterior, como discutido anteriormente. A análise das atividades de -amilase in vitro de Z.
subfasciatus oriundos dos diferentes cruzamentos mostraram
padrões semelhantes (Fig. 8). Porém, intestinos de larvas oriundas do cruzamento entre fêmeas virgens que emergiram de V.
unguiculata com machos virgens que emergiram de P. vulgaris,
mostraram maior atividade quando comparado com os outros cruzamentos, o que reforça a possibilidade da colaboração paternal. No entanto, a indiferença estatística pode fazer com que se descarte esta possibilidade.
Analisamos a performance de Z. subfasciatus em transições de sementes de V. unguiculata e P. vulgaris (Tabela 1). A presença do αA-1, em sementes de P. vulgaris pode estar ligada à diminuição do desempenho desses insetos nesses grãos, uma vez que isso representa um estresse biológico para os mesmos. O desafio de lidar com o αA-1 pode estar fazendo com que eles necessitem mais tempo para completar o seu ciclo de vida, assim como a diminuição da porcentagem de sobrevivência. O que pode explicar os diferentes dias de atingimento do 4° instar larval de Z. subfasicuatus nessas duas espécies de leguminosas (item 3.6). A passagem de uma parental em sementes de V. unguiculata mostrou gerar uma prole mais eficaz em se desenvolver em sementes de P. vulgaris, possuindo um índice de Howe mais elevado quando comparado a uma parental vinda de P. vulgaris, mostrando menores desempenhos em sementes de P. vulgaris (índice de Howe 0.058 e 0.050, respectivamente). O que sugere que dependendo da espécie leguminosa, da qual uma parental de Z. subfasciatus tenha tido seu ciclo de vida, ela irá afetar o desempenho de sua prole.
geracionais nessas sementes podem nos trazer maiores confirmações acerca da herança da expressão constitutiva das duas isoformas de -amilase, assim como da colaboração parental desta indução, e dos desempenhos que esses insetos adquirem ao longo de transições entre essas leguminosas. Pesquisas que envolvam mais de uma geração de Z. subfasciatus em P. vulgaris e V.
6.CONCLUSÕES
• A passagem de somente uma geração de Z. subfasciatus em sementes de P. vulgaris mostrou ser incapaz de promover a herança da expressão constitutiva das duas isoformas de - amilases induzidas para uma prole em V. unguiculata. • Os resultados da análise da colaboração maternal e/ou
paternal para a herança das duas isoformas de -amilases induzidas mostraram ser inconclusivas, sendo necessário a repetição dos experimentos.
• O contato de Z. subfasciatus com o A-1 presente em sementes de P. vulgaris pode ser um dos fatores que proporcionam um aumento no seu tempo médio de desenvolvimento e um possível comprometimento do desenvolvimento de sua prole.
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