Os resultados observados nos experimentos 1A e 1B mostram que a inativação do SubD com muscimol, seja realizada antes ou após o treino, provocou prejuízo no CMC. O bloqueio NMDA com AP5, por sua vez, provocou prejuízo apenas quando realizado após o treino dessa tarefa. Nos experimentos com EI ST (2A e 2B), não foram observados efeitos das manipulações por muscimol e AP5, sobre a latência, tampouco sobre o congelamento no compartimento escuro, dos animais em ambos momentos de infusão no SubD. Esses resultados estão sumarizados na Tabela 1.
Tabela1. Sumário de resultados
Pré-treino Pós-treino CMC Muscimol AP5 - EI ST Muscimol - - AP5 - - Fonte: o autor (2019)
As inativações temporárias por infusão de muscimol no SubD provocaram prejuízos quando realizadas antes ou após o treino do CMC, o que indicaria que esta região poderia estar envolvida tanto na aquisição quanto na consolidação da tarefa. Contudo, como o efeito do muscimol começa quase imediatamente após sua infusão e se mantém estável por horas (Hikosaka & Wurtz, 1985; Martin, 1991; Krupa et al., 1999), a droga continua ativa por um período após a tarefa, podendo atuar durante a fase de consolidação, uma vez que também foi observado efeito pós-treino.
Desse modo, é possível que o efeito deletério da administração do muscimol antes do treino, observado em nosso estudo, esteja mais relacionado com a consolidação do que com a aquisição da tarefa. Além disso, é observado que inativações optogenéticas no SubD durante o treino não prejudicam o desempenho dos animais no CMC (Roy et al.,2017), sugerindo que essa região não está envolvida na aquisição da tarefa.
Por serem manipulações diferentes, poderia ser sugerido que a distinção observada nos resultados, com a presente inativação farmacológica apresentando
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efeito na aquisição e a optogenética não, seria decorrente de alguma diferença nos mecanismos envolvidos em cada técnica. Dessa maneira, algumas diferenças entre essas formas de manipulação devem ser destacadas.
Primeiro, as inativações optogenéticas em Roy et al., (2017) ocorreram através de hiperpolarizações reguladas por Archaerhodopsins geneticamente modificadas que controlam bombas de prótons e promovem o efluxo desses elementos diante da presença de luz verde. Nossas inativações farmacológicas, por sua vez, se deram por meio de hiperpolarizações controladas por canais de cloreto, com influxo desses íons após a infusão do muscimol (Johnston, 2014).
Segundo, a técnica de optogenética apesenta extrema precisão celular, atuando especificamente em neuronios de interesse (Dugué et al., 2012). Em Roy et al. (2017), as células dorsosubiculares inativadas foram neurônios exclusivamente excitatórios marcadores de CaMKII+. Por outro lado, inativações por muscimol, como em nosso caso, não se restringem a um especifico grupo de células, atuando sobre diferentes tipos de neurônios, como interneurônios gabaérgicos presentes no SubD (Martin, 1991; Witter & Amaral, 2004).
Terceiro, além da precisão celular, manipulações optogenéticas apresentam grande precisão temporal, atuando apenas durante a exposição da luz (Dugué et al., 2012), ao contrário de manipulações farmacológicas, que podem apresentar efeito prolongado por alguns minutos ou horas (Allen et al., 2008; Kitamura et al., 2009). Um estudo que investigou a questão da precisão temporal dessas técnicas no CMC mostrou que somente a inativação optogenética precisa -apenas durante o teste- do HD prejudicou o desempenho dos animais. Por sua vez, a inativação optogenética prolongada -30min antes e durante a teste- dessa região, simulando um efeito farmacológico, não provocou prejuízo. Assim, o HD seria necessário para evocação tardia apenas quando não haveria tempo para o engajamento de mecanismos compensatórios (Goshen et al., 2011).
Embora representem uma possível linha de interpretação, essas diferenças não parecem ser a melhor explicação para nossos resultados. Em contra-argumentação a esta linha, há na literatura evidências que indicam uma semelhança de resultados entre inativações optogenéticas e farmacológicas na aquisição do CMC e também do condicionamento de medo ao som. Em estruturas como amígdala e hipocampo, o
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mesmo padrão de resultados observados após manipulações farmacológicas é visto em estudos optogenéticos, validando a equivalência funcional dessas técnicas nesses paradigmas (Goshen et al., 2011).
Assim, apesar da administração pré-treino ter provocado prejuízo no desempenho da tarefa, nossos dados, em conjunto com a literatura, sugerem que a ação do muscimol se deu após o treino da tarefa, ou seja, no período de consolidação do CMC. Dessa forma, a inativação temporária do SubD com muscimol apresenta resultados semelhantes aos observados no HD, onde essa manipulação também prejudica apenas a fase de consolidação do CMC (Chang & Liang, 2012; Maren & Holt, 2004).
Nas manipulações com infusões de AP5 no SubD, houve prejuízo no CMC apenas quando a administração ocorreu após o treino. Neste caso, o efeito da droga mostra o envolvimento dessa região no período de consolidação da informação. Este resultado sugere que a participação de mecanismos relacionados à plasticidade sináptica no SubD é necessária durante a consolidação de memórias contextuais de medo. A atuação do subículo, através de vias que podem apresentar plasticidade sináptica dependente de NMDA (Commins et al., 1998; O’Mara, 2000; Craig & Commins, 2006; Behr et al., 2009; Wozny et al., 2008), na ligação indireta entre hipocampo e CE, regiões envolvidas na consolidação do CMC (Chang & Liang, 2012; Baldi et al., 2013), pode estar relacionada com este resultado.
O efeito do AP5 observado em apenas um momento de manipulação (imediatamente pós-treino) pode estar relacionado com as propriedades celulares dos neurônios piramidais do subículo, que podem ser modificáveis a curto e longo prazo (Behr et al., 2009). Além disso, o tempo de ação dessa droga, ao contrário do muscimol, parece ser curto, visto que outros trabalhos de nosso laboratório também observaram efeito apenas em um momento de manipulação -imediatamente pré- treino- (De Oliveira Coelho et al., 2013; Schenberg & Oliveira, 2008). Isto sugere que o resultado negativo observado após a infusão pré-treino de AP5 no SubD não parece estar relacionado com um possível efeito chão provocado por estresse pelo curto intervalo entre treino e infusão. Ademais, a inspeção visual do gráfico pode sugerir uma possibilidade de efeito em caso de aumento amostral. Neste caso, o SubD poderia estar envolvido na aquisição do CMC através de transmissões
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glutamatérgicas dependentes de NMDA. Contudo, esta possibilidade não compromete o achado principal do presente estudo, qual seja, o envolvimento do SubD na consolidação do CMC.
Curiosamente, este padrão de resultados observados no SubD é distinto daquele visto no HD, onde o bloqueio de receptores NMDA com AP5 afeta apenas a fase de aquisição de memória no CMC (De Oliveira Coelho et al., 2013; Schenberg & Oliveira, 2008). Talvez a possibilidade das plasticidades envolvidas nas conexões entre hipocampo e subículo serem reguladas de forma independente esteja ligada a essa distinção de resultados entre as estruturas (Kunitake et al., 2004; Behr et al., 2009). Essa distinção entre HD e SubD a partir da mesma manipulação pode sugerir que o subículo, apesar de sua densa ligação com a região CA1 (Witter & Groenewegen, 1990), pode apresentar propriedades funcionais independentes do hipocampo, não sendo apenas um simples canal de transição no circuito hipocampal (De La Prida et al., 2006; Aggleton & Christiansen, 2015).
Os resultados negativos de nosso experimento controle (2A e 2B) sugerem que a porção dorsal do subículo não está envolvida com aprendizagem instrumental. Essa sugestão está de acordo com resultados que, embora derivados de uma tarefa comportamental diferente da esquiva -estímulos apetitivos-, indicam que o SubD parece não participar desse tipo de aprendizagem (Andrzejewski et al., 2006). Além disso, nossos resultados corroboram a ideia de que nossa versão de EI ST é hipocampo/contexto independente. Outro estudo de nosso laboratório mostrou que, ao passo em que a infusão pré-treino de AP5 no HD prejudicou o desempenho de animais treinados e testados no CMC, manipulações pré-treino de AP5, muscimol ou escopolamina no HD neste mesmo protocolo de EI ST não surtiram efeito (Favaro, 2019). Ademais, o fato de nossas manipulações interferirem apenas com o CMC e não com a EI ST, mostra que os elementos em comum entre as duas tarefas, como sensibilidade ao choque e reatividade emocional a um estimulo aversivo, além de um efeito de aprendizado geral, não seriam responsáveis pelos prejuízos observados.
Isto sugere que provavelmente os efeitos observados nos experimentos de CMC (1A e 1B) estão relacionados ao envolvimento do SubD com aspectos contextuais. Desse modo, parece haver uma dissociação entre os paradigmas utilizados na qual os aspectos contextuais avaliados no CMC não estão
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suficientemente salientes em nosso protocolo de EI ST para recrutar regiões hipocampais.
No entanto, ao conhecimento de nossa revisão, não existem estudos que investiguem a participação do SubD em qualquer versão de esquiva inibitória. O único trabalho envolvendo o subículo nesta tarefa se restringe à porção ventral dessa estrutura (Liu & Liang, 2009). Além disso, o presente protocolo utilizou apenas uma dose, não fazendo uma curva dose-resposta. Logo, embora nossa versão da EI ST possa ser usada como controle de nossos experimentos de CMC, mais estudos com diferentes versões de esquiva inibitória, como a step-down, bem como com diferentes doses, são necessários para verificar se de fato o SubD não está envolvido na tarefa.
Neste sentido, compreende-se a relevância da discussão dos presentes resultados, bem como da necessidade, a fim de um melhor entendimento sobre o tema, de novas pesquisas que contemplem a investigação de mecanismos neurobiológicos envolvidos na relação do subículo, em particular do SubD, com a aprendizagem aversiva. Por exemplo, como já é mostrada a participação do SubD na evocação do CMC via optogenética (Roy et al., 2017), interessante seria, como direcionamento futuro, realizar uma manipulação farmacológica pré-teste nessa região, para corroborar ainda mais a equivalência funcional entre essas técnicas.