A criptococose é doença fúngica importante que vem despertando interesse cada vez maior entre os pesquisadores devido a sua associação com os pacientes imunocomprometidos, em especial aqueles com Aids. Segundo o boletim, HIV/Aids das Nações Unidas e Organização Mundial da Saúde (http://www.unaids.org/en/), mais de 40 milhões de pessoas no mundo estão infectadas pelo vírus HIV e cerca de três milhões morrem todos os anos. Considerado como um dos critérios para estabelecer o diagnóstico de Aids, a meningite criptocócica é a infecção fúngica mais comum do sistema nervoso central e a terceira complicação neurológica mais freqüente entre os pacientes com a síndrome (DEL VALLE E PINA-OVIEDO, 2006). No Brasil, de 1980 a 2005, 371.827 casos de Aids foram relatados e estima-se que 5 a 10% destes pacientes são acometidos por esta micose (BRASIL, 2005).
A primeira parte de nosso estudo preocupou-se em verificar a prevalência dos principais tipos moleculares, mating type e sorotipos de isolados de C. neoformans do Estado de São Paulo e Rio de Janeiro. Neste estudo, 106 isolados foram obtidos de 58 pacientes com doença associada ou não a Aids. Destes, 104 foram identificados como C. neoformans var grubii, sorotipo A e apenas dois pertencentes ao Estado do Rio de Janeiro foram identificados como C. gattii, consistente com a literatura mundial e também a nacional, de que C. neoformans var grubii, sorotipo A é prevalente entre os pacientes imunossuprimidos, principalmente os HIV positivos (MITCHELL e PERFECT, 1995; CASADEVALL e PERFECT, 1998; CASALI et al., 2003; NISHIKAWA et al., 2003;
BARRETO de OLIVEIRA et al., 2004). A determinação das variedades foi realizada por métodos clássicos em meio CGB e confirmado por PCR utilizando seqüências iniciadoras específicas.
Tradicionalmente, a identificação das espécies C. neoformans e C. gattii pode ser realizada em meio de canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) em que só a espécie C. gattii é resistente a canavanina e é capaz de utilizar a glicina como única fonte de carbono e nitrogênio, levando a alcalinização do meio e sua mudança de cor. O aparecimento de isolados C. neoformans CGB falsos positivos (ou negativos) tem levado os pesquisadores a buscar métodos mais específicos para identificação dos isolados. As técnicas baseadas na PCR vem sendo uma ótima alternativa, mostrando-se, mais sensíveis, específicas e rápidas e sofrendo menos influência de fatores externos do que os métodos tradicionais baseados em aspectos fenotípicos (AOKI et al., 1999; LENGELER et al., 2001; D’SOUZA et al., 2004; LEAL, 2006). Em nosso estudo, a concordância entre os métodos clássicos e moleculares foi de 100%, ao contrário de Leal (2006) que encontrou discordância em seis (4,55%) de 132 isolados analisados, sendo os métodos moleculares mais específicos.
C. neoformans é basidiomiceto heterotálico possuindo dois mating types opostos (α e a). O cruzamento envolve a fusão de células haplóides α e a e a formação de hifas dicarióticas e basídios
com quatro cadeias de basidiósporos (KWON-CHUNG, 1975). Apesar dos basidiósporos serem produzidos, na proporção de um α, para um a, o que se observa, tanto em isolados ambientais, quanto em isolados clínicos, é uma predominância quase absoluta do tipo α , em torno de 98-99,9%
(LIN e HEITMAN, 2006). Em nosso estudo, a análise epidemiológica dos mating types, determinadas por PCR, mostrou prevalência de 100% de MATα, quadro semelhante ao encontrado na literatura mundial e nacional (CASALI et al., 2003; TRILLES et al., 2003; LIN e HEITMAN, 2006; ABEGG et al., 2006). O motivo desta predominância não está bem claro. Estudos têm mostrado que a frutificação haplóide, nome que se dá a passagem da forma assexuada para a forma sexuada sem haver o encontro dos mating types opostos, ocorre predominantemente em cepas MATα (WICKES et al., 1996; LIN e HEITMAN, 2006). Lin et al. (2005) verificaram que cepas do mesmo mating type (α) foram capazes de se fundirem e formarem hifas, basídios e basidiósporos, em um processo semelhante a frutificação haplóide, mas com meiose e, consequentemente, troca de material genético, característico de reprodução sexuada. Por fim, o tipo sexual parece exercer papel importante na virulência de C. neoformans, cepas que diferiam apenas em seu mating type foram comparadas em infecção experimental e as cepas MATα foram mais virulentas do que as MATa (KWON-CHUNG et al., 1992). Além disso, foi demonstrado que cepas MATα invadem o sistema nervoso central com mais eficiência do que as MATa, durante uma coinfecção (NIELSEN et al., 2005).
Neste estudo, os 106 isolados foram tipados por RAPD e PCR-fingerprinting com o iniciador (GACA)4 e ainda confirmado por RFLP do gene PLB1. O tipo molecular VNI foi o mais prevalente entre os isolados (91,5% = 97/106), seguido pelo VNII (6,6% = 7/106) e por último o VGII com apenas dois isolados (1,9%). A tipagem molecular por RAPD, ao contrário do PCR-fingerprinting, mostrou maior polimorfismo, comprovada pela média de similaridade menor (0,81 ± 0,1) comparada ao PCR-fingerprinting (0,93 ± 0,1) e formação de maior número de clusters como observado no dendrograma. Além disso, foi observada a formação de um grupo (II) contendo isolados do tipo VNI junto com VNII e formação de grupos com isolados similares por PCR-fingerprinting e com baixa correlação por RAPD e vice versa (isolados do grupo III). Estudos epidemiológicos são essenciais para o entendimento da biologia e da estrutura populacional de um microorganismo. Vários métodos de tipagem molecular vêm sendo utilizados em análise epidemiológica de C. neoformans, como por exemplo, cariotipagem, PCR-fingerprinting, RAPD, RFLP e AFLP (BOEKHOUT et al., 1997; GARCIA-HERMOSO et al., 1999; BOEKHOUT et al., 2001; CALVO et al., 2001; CASALI et al., 2003; MEYER et al., 2003; TRILLES et al., 2003;
BARRETO DE OLIVEIRA et al., 2004; IGREJA et al., 2004; DELGADO et al., 2005). As técnicas de PCR-fingerprinting com iniciadores mini (M13) ou microsatélite (GACA)4 específicos e RFLP
dos genes PLB1 e URA5 vem sendo utilizados em levantamentos globais, dividindo os isolados em oito tipos moleculares principais, denominados VNI e VNII (C. neoformans var. grubii, sorotipo A), VNIII (C. neoformans, sorotipo AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans, sorotipo D) e VGI a VGIV (C. gattii, sorotipos B e C) (MEYER et al., 1999; LATOUCHE et al., 2003; MEYER et al., 2003). Vários estudos têm verificado uma predominância do tipo molecular VNI tanto em isolados ambientais quanto em clínicos. Um estudo Iberoamericano realizado com cepas de nove países, incluindo o Brasil, mostrou prevalência do tipo VNI entre os 340 isolados tipados. Mais especificamente, 66 isolados do Brasil foram incluídos, sendo 44 da região sudeste, 11 da região sul e 11 da região nordeste, dentre estes, o tipo VNI foi predominante com 82,3% seguido do VGII (13,6%) e VNII (3,0%) (MEYER et al., 2003). Casali et al. (2003), em importante estudo na região sul do Brasil, investigaram 105 isolados clínicos e 19 ambientais e também verificaram predominância do VNI. Mais recentemente, Escandon et al. (2006) analisaram 425 isolados (178 clínicos e 247 ambientais) de C. neoformans da Colômbia, dentre estes, os mais predominantes foram o VNI (269 isolados), seguido do VGII (119) e com menor número de isolados, VGIII (22), VGIV (10), VNII (3) e VGI (1). Em nosso estudo, apenas dois isolados seqüenciais de um paciente foram identificados como C. gattii, tipo molecular VGII. O tipo VGII tem chamado a atenção dos pesquisadores devido a um surto de criptococose causado por cepas hipervirulentas, acometendo humanos e também animais, em zonas temperadas, como em Vancouver Island, Canadá (STEPHEN et al., 2002; KIDD et al., 2004). A questão sobre a origem geográfica destas cepas e como elas chegaram ao Canadá é motivo de discussão. Quando um dos isolados, obtido durante o surto, foi comparado a dois dos EUA e um do Brasil pela técnica de multilocus sequence typing (MLST), mostrou-se 100% identico aos dos EUA e diferente em apenas um locus dos 30 analisados, quando comparado ao isolado brasileiro, abrindo a possibilidade de isolados da América do sul ser a origem do surto (FRASER et al., 2005). No presente trabalho, quatro isolados seqüenciais de um paciente do Rio de Janeiro que formaram um terceiro grupo (III) e correlacionaram em 0,7 com os grupos I (VNI) e II (VNII), foram tipados como VNI por RFLP.
Subpopulações de C. neoformans, em particular da variedade grubii, apresentando perfis genotípicos distintos e/ou limitados a uma região geográfica vem sendo relatados. Litvintseva et al., 2005, pela técnica de MLST, separaram mais de 1000 isolados de C. neoformans var. grubii em três grupos principais sendo que um destes grupos foram formados por isolados unicamente de Botswana, África. Em outro, Barreto de Oliveira et al. (2004), pela técnica de AFLP, encontraram grande diversidade genética entre os isolados brasileiros, incluindo um subgrupo novo entre os isolados da var. grubii. A estrutura genética de C. neoformans é bastante complexa e o emprego de novos iniciadores, bem como, outras técnicas moleculares são importantes e necessários para elucidar sua epidemiologia. No Estado do Rio Grande do Sul, a variabilidade genética de isolados
clínicos e ambientais foi testada por 22 iniciadores aleatórios, dentre estes, oito comprovaram o polimorfismo (HORTA et al., 2002). Em outro estudo, IGREJA et al. (2004) identificaram numerosos subtipos entre isolados seqüenciais recuperados de pacientes com Aids. Recentemente, 83 isolados de várias regiões do Estado de São Paulo foram tipados por cariotipagem eletroforética e RAPD, 22 e 15 perfis foram encontrados, respectivamente (ALMEIDA et al., 2006).
A tipagem molecular é potencialmente útil em esclarecer casos de recidivas por persistência da cepa ou reinfecção por uma nova cepa, demonstrando os graus de relação entre os isolados no início e em infeções posteriores de um mesmo paciente. Vinte e sete dos 58 pacientes selecionados para este estudo, possuíam isolados seqüenciais. Destes, apenas cinco tiveram mudanças no perfil genético. No entanto, com exceção de um paciente, o qual foi infectado pelos tipos moleculares VNI e VNII, os quatro restantes apresentaram coeficiente de similaridade alta > 0,9. Estes resultados sugerem que a persistência da cepa seja a maior responsável pelas recaídas dos pacientes, mais do que a reinfecção por uma nova cepa. No Brasil, isolados seriais de C. neoformans, recuperados em diferentes intervalos de tempo e também de sítios diferentes (sangue e líquor), foram analisados por PCR-fingerprinting e RAPD, para verificar se ocorre persistência ou reinfecção por uma nova cepa e se ocorre coinfecção por duas cepas diferentes. Os resultados sugeriram que a persistência da cepa é a maior responsável pelos relapsos e que em alguns casos, podem ocorrer coinfecção por cepas diferentes (IGREJA et al., 2004). A identificação de pequenas mudanças no perfil genético é de grande importância, pois pode ser indicativo de microevolução, que por sua vez, pode traduzir em mudanças fenotípicas como, por exemplo, na virulência, na resistência a antifúngicos ou na alteração à resposta imune do hospedeiro (JAIN et al., 2005). Fries e Casadevall (1998), comparando isolados seqüenciais que apresentaram mudança no perfil de cariótipo, verificaram diferenças na virulência em animais de laboratório, bem como, na capacidade de crescimento a 37°C e na produção da cápsula. Em outro, uma cepa padrão, mantida in vitro por longo período de tempo em seis laboratórios diferentes, da mesma forma, apresentaram diferenças nos perfis de cariótipo associados às mudanças de virulência, na morfologia colonial, na produção de cápsula, na melanização e na produção de proteinases extracelulares (FRANZOT et al., 1998).
Mais recentemente, Jain et al. (2005) pelas técnicas de cariotipagem eletroforética e RFLP e Almeida et al., (2006) por cariotipagem e RAPD, verificaram entre isolados seqüenciais, evidências de microevolução associados à diminuição da sensibilidade a antifúngicos e também de coinfecção por duas cepas diferentes.
A meningite criptocócica é a forma clínica mais comum e a mais importante da doença, apresentando alto índice de letalidade, se tratada tardiamente (CASADEVALL e PERFECT, 1998).
O tratamento dos pacientes HIV+ com a terapia antiretroviral provocou uma queda no índice de
criptococose, no entanto, a doença pode se manifestar mesmo durante este tratamento e o prognóstico continua a ser desfavorável (DROMER et al., 2004; FRIEDMAN et al., 2005). O tratamento de escolha para esta infecção, consiste na terapia primária com anfotericina B conjugada ou não a 5-fluorocitosina, seguida de manutenção com fluconazol por tempos prolongados (SAAG et al., 2000). Entretanto, a taxa de letalidade continua consideravelmente alta, em torno de 9,4%
(VAN Der HOST et al., 1997). Por outro lado, taxas altas de persistência e freqüentes recidivas da doença têm causado uma preocupação crescente entre os clínicos a respeito do potencial para o surgimento de cepas resistentes aos antifúngicos (BERG et al., 1998; BRANDT et al., 1996). Em vista disto, pretendeu-se determinar os perfis de sensibilidade a quatro drogas antifúngicas por métodos padronizados de microdiluição (CLSI) portaria M27A-2. Valores de CIM relativamente altos foram encontrados entre os isolados clínicos testados neste estudo, provenientes do Estado de São Paulo e Rio de Janeiro, podendo ser verificada pelos percentuais de isolados, com perfis de sensibilidade dose-dependente (azóis) e intermediários (5-fluorocitosina). Além disso, um percentual significativo de isolados com CIM ≥ 1µg/mL para anfotericina B foi encontrado (18,9%), no entanto, o ponto de corte para esta droga ainda não foi estabelecido. Trabalhos anteriores têm considerado o ponto de corte ≥ 2µg/mL como o de isolados resistentes (NGUYEN e YU, 1998; LOZANO-CHIU et al., 1998; PFALLER et al., 2005b). Assim, se levarmos em conta apenas àqueles isolados que apresentaram CIM ≥ 2µg/mL, tivemos em nosso trabalho, apenas um (1) isolado resistente (0,9% - paciente 22, isolado 93), concordando com o trabalho realizado por Pfaller et al. (2005b), em que analisaram 1811 isolados clínicos provenientes de cinco regiões globais no período de 1990 a 2004 e verificaram que menos de 1% dos isolados, foram resistentes a fluconazol (≥ 64µg/mL) e anfotericina B (≥ 2µg/mL). Por outro lado, a prevalência de isolados resistentes a 5-fluorocitosina observado neste trabalho (30,2%), foi discordante do trabalho anterior, porém concordante aos trabalhos de Pappalardo et al. (1998) e Pedroso et al. (2006). Recentemente, 16 isolados ambientais de C. neoformans, 17 de C. albidus, 14 de C. laurentii, e 3 de C.
uniguttulatus, obtidos na região de Ribeirão Preto, foram avaliados com as mesmas quatro drogas testadas neste trabalho, sendo que a 5-fluorocitosina foi a que apresentou maior índice de determinaram a CIM por e-test para cinco drogas (anfotericina B, fluconazol, itraconazol, cetoconazol e 5-fluorocitosina) em 48 isolados (30 C. neoformans e 18 C. gattii). Nenhum isolado
foi resistente a anfotericina B e cetoconazol, mas para 5-fluorocitosina, fluconazol e itraconazol,
(2005), da mesma forma, não encontraram resistência entre os 110 isolados testados (70 clínicos e 40 ambientais) com anfotericina B, itraconazol, fluconazol e ravuconazol, entretanto, foram observadas CIMs maiores entre os isolados clínicos comparado aos ambientais. Em nosso estudo, apenas o paciente 3 do Rio de Janeiro apresentou variação significativa de CIM para fluconazol de 2 para 64 µg/mL, dentre os 27 pacientes com isolados seqüenciais neste estudo. Todos os isolados pertenciam ao mesmo tipo molecular, sugerindo que pode ter ocorrido adaptação da cepa durante a terapia, resultando em aumento da resistência à droga, como já relatado em trabalhos anteriores (FRIESE et al., 2001; RODERO et al., 2003). A epidemiologia de C. neoformans é bastante complexa e tem sido amplamente estudada no mundo inteiro dado a sua importância como um dos principais patógenos associados a pacientes imunocomprometidos. No Brasil, a população de pessoas HIV+ é grande (>300.000), entretanto, os dados epidemiológicos sobre a criptococose e seu agente etiológico, associada a este grupo de pessoas, ainda são escassos e insuficientes. Assim, cremos que neste estudo trouxemos informações importantes sobre a epidemiologia de C.
neoformans, enriquecendo os dados epidemiológicos nacionais existentes.
Mais recentemente, vários fatores de virulência foram identificados como importantes para a patogenia de C. neoformans, dentre estes, os três mais estudados são a capacidade de crescimento a 37oC, a produção de melanina e a cápsula polissacarídica, além de mating type, enzimas e moléculas de sinalização celular (CASADEVALL e PERFECT, 1998; IDNURM et al., 2005). C. neformans é levedura de distribuição ubiquitária com grande capacidade de adaptação. A exposição aos esporos ou células com pouca cápsula leva a um quadro de infecção que pode ser assintomático e rapidamente curado ou permanecer latente no pulmão por longo período de tempo na forma de granuloma. Em pacientes imunocomprometidos, o fungo pode disseminar dos pulmões para outros órgãos, atingindo principalmente, o sistema nervoso central causando a meningoencefalite que é fatal se não tratada (IDNURM et al., 2005). Por outro lado, a forma pulmonar é pouco descrita e esta fase pode ser pouco percebida e mesmo não diagnosticada.
Portanto, o estudo dos prováveis genes envolvidos durante a infecção pulmonar é de grande importância para compreender os mecanismos de interação iniciais entre a levedura e o hospedeiro. A meningite criptocóccica ainda é problemática neste grupo de pessoas e esta identificação poderá redundar em novas abordagens para circunscrever o processo de
disseminação. A técnica de RDA foi empregada neste estudo, buscando caracterizar cDNA diferencialmente expressos durante a infecção de C. neoformans, após recuperação da cepa de tecido pulmonar. Esta metodologia foi empregada com sucesso para estudar a interação parasito-hospedeiro em outros fungos como Paracoccidioides brasiliensis (BAILÃO et al., 2006), mas em C. neoformans, até o momento, não temos conhecimento de trabalho algum, enfocando esta interação inicial. Neste estudo, oito transcritos foram identificados na condição de infecção, sendo que quatro delas apresentaram maior redundância (transportador de zinco, transportador de cálcio, chaperona e piruvato decarboxilase). expressão de genes de C. neoformans recuperados do sistema nervoso central de coelhos, verificou expressão aumentada de transportadores de zinco, sugerindo um papel importante para a sua sobrevivência no hospedeiro. O transporte de metais, tais como, ferro, cobre e zinco, são importantes para a função de muitas proteínas, pois eles estabilizam a estrutura protéica e facilitam as reações de oxiredução (RADISKY e KAPLAN, 1999). Neste sentido, embora, em nosso estudo, não tenhamos encontrado nehuma enzima relacionada à detoxificação celular, é possível que indiretamente, a expressão aumentada de transportador de zinco, seja reflexo, de uma maior necessidade de enzimas que eliminem espécies reativas de oxigênio, tais como a superóxido dismutase citosólica que é uma enzima Cu/Zn dependente importante para detoxificação da célula durante o metabolismo oxidativo e o burst respiratório na resposta imune e ainda considerado como um fator de virulência em potencial (COX et al., 2003; NARASIPURA et al., 2003; NARASIPURA et al., 2005; DIAS et al., 2006).
Outro transportador encontrado em nosso estudo que apresentou alta redundância foi o de cálcio. Assim como o transportador de zinco, é possível que outras moléculas dependentes de cálcio estejam envolvidas, como por expemplo, a calcineurina que é uma fosfatase ativada por Ca+2/calmodulina. Vários estudos têm demonstrado que a atividade de calcineurina e o influxo de cálcio na célula são interrelacionados e rigorosamente controlados para que possam exercer suas funções na adaptação do fungo frente a mudanças do ambiente, na regulação da morfogênese e na patogenia (FOX e HEITMAN, 2002). Em C. neoformans, a enzima parece ter papel fundamental para o crescimento a 37oC, para a filamentação e para a virulência em animais de laboratório (ODOM et al., 1997; CRUZ et al., 2000; FOX et al., 2001; CRUZ et al., 2001; FOX et al., 2003;
KRAUS e HEITMAN, 2003; KRAUS et al., 2005). Kraus et al. (2003), verificaram que cepas que tiveram a atividade da calcineurina rompida (por mutação ou por uso de inibidor), apresentaram mudanças na expressão de genes envolvidos em biossintese de parede, sugerindo papel importante da calcineurina para manutenção da integridade da parede celular.
Outra proteína com alta redundância encontrada em nosso trabalho, foi o regulador de chaperona (= heat shock protein) que regula a atividade de um grupo de proteínas Heat schock protein (HSP) com massa molecular em torno de 70KDa. As HSP são produzidas pelas próprias células em resposta a condições de estresse, permitindo a sobrevivência do microrganismo em ambientes ou em situações hostis (GARRIDO et al., 2001; PARCELLIER et al., 2003). Estas , coordenam o armazenamento e liberação de proteínas, a degradação de proteínas instáveis, auxiliam na prevenção de agregação protéica e também no transporte interno das mesmas (STEEN et al., contrário do teste in vivo, in vitro não houve expressão aumentada quando cultivado a 37°C, não só da HSP70, mas também das HSP60 e HSP90 (STEEN et al., 2002), sugerindo a existência de outros fatores de estresse que estimulem uma maior transcrição destes genes. Ainda no mesmo trabalho, foi verificado que outro fator poderia ser a privação de ferro que ocorre durante a infecção no hospedeiro. Esta privação pode, por sua vez, ser resultante da ação de neutrófilos num mecanismo de ação semelhante ao da privação de zinco (LULLOFF et al., 2004).
Por fim, foi encontrada alta redundância para a enzima piruvato decarboxilase, cuja função está relacionada ao metabolismo de carboidratos. Em C. neoformans, especificamente, esta enzima faz parte da via de neoglicogênese, produzindo (alfa-hidroxietil) tiamina difosfato (= 2-hidroxietil-ThPP) e acetaldeido (anexo 4). A expressão aumentada de piruvato decarboxilase vem sendo relatada, não só em condição de infecção ou estresse, mas também em condições ideais de crescimento (STEEN et al., 2002 e 2003; LIAN et al., 2005). O fato dos produtos 2-hidroxietil-ThPP e acetaldeído serem, por sua vez, substratos para uma ampla variedade de enzimas pertencentes a outras vias metabólicas, explicaria em parte esta questão, porém maiores investigações são necessárias para se estabelecer, com mais exatidão, quais fatores estimulam a expressão deste gene. Ao contrário de trabalhos realizados por Dutra et al., 2004, por Bailão et al.
(2006) e recentemente por Baeza (2006), neste trabalho foi encontrada uma variabilidade menor de proteínas (oito tipo de proteínas), após a pesquisa no banco de dados (BLASTx). Este fato inesperado pode ter ocorrido devido à passagem da cepa (recuperada do pulmão) pelo meio de
cultura ou talvez pelo número relativamente baixo de seqüências analisadas. A interação fungo-hospedeiro durante a infecção criptocóccica é extremamente complexa e ainda não foi suficientemente explorada. Neste sentido, os dados obtidos neste trabalho podem contribuir para um melhor entendimento desta interação.