Neste trabalho foram avaliadas a atividade antibacteriana do óleo essencial do caule de C. tricolor (CT-OEc) frente a linhagens de importância clínica (S. aureus e E. coli), a atividade oxidante e anti-oxidante frente a eritrócitos humanos do tipo O, o potencial citotóxico frente a eritrócitos humanos dos tipos sanguíneos A, B e O, e o potencial clastogênico e aneugênico através do teste do micronúcleo em medula óssea de roedores in
vivo.
O crescente aparecimento de resistência bacteriana impõe um fardo econômico e social enorme sobre o sistema de saúde em todo o mundo e, infelizmente, o desenvolvimento de novos antibióticos é vastamente ultrapassado por terapias atuais que estão perdendo a sua eficácia (BROOKS; BROOKS, 2014). A resistência ocorre para praticamente todas as classes de antibióticos de uso corrente. O desenvolvimento de resistência bacteriana a um dado antibiótico é prevista para se desenlvolver dentro de um prazo médio de 50 anos após a utilização inicial (BHATT ET AL., 2013). A epidemia global de infecções causadas por bactérias resistentes juntamente com um declínio no número de novos antibióticos que entram na fase de desenvolvimento clínico tem levado a busca por classes alternativas de agentes antimicrobianos (SPELLBERG, 2008).
Os principais grupos de compostos que são responsáveis pela atividade antimicrobiana a partir de plantas incluem fenóis, ácidos fenólicos, quinonas, saponinas, flavonóides, taninos, cumarinas, terpenóides, e alcalóides (CIOCAN; BARA, 2007; LAI; ROY, 2004). Variações na estrutura e composição química destes compostos resultam em diferenças em sua ação antimicrobiana (SAVOIA, 2012).
A literatura apresenta vários relatos de estudos de atividade antimicrobiana com variadas espécies de Croton, incluindo trabalhos com óleos essenciais; Fortes e Guedes (2006) observaram a presença de sensibilidade de linhagens de Streptococcus spp., Serratia spp., Staphylococcus spp., Proteus mirabilis, Enterobacter spp. e Pseudomonas
Em estudo realizado por Rodrigues, Costa e Coutinho (2009), observou-se a presença de sinergismo do óleo essencial de C. zehntneri com gentamicina contra P. aeruginosa. Ajayi e Akintola (2010), avaliaram a atividade antibacteriana do extrato das folhas de C. zambesicus sobre patógenos entéricos de origem alimentar, verificando efetividade contra
Escherichia coli e Salmonella typhimurium.
Jeeshna, Paulsamy e Mallikadevi (2011), em pesquisa sobre a atividade antimicrobiana de C. bonplandianum Baill, demonstraram que o extrato metanólico das folhas inibiu efetivamente o crescimento de
Staphylococcus aureus, Pseudomonas sp., Escherichia coli, Bacillus subtilis e Salmonella typhi e dos fungos Mucor spp., Aspergillus flavus, Rhizopus spp.
e Pencillium spp.
C. tricolor também tem sido objeto de pesquisa da atividade
antimicrobiana por parte de alguns pesquisadores. Miranda (2012) avaliou a atividade antibacteriana do óleo essencial extraído das folhas e do caule do C. tricolor contra linhagens bacterianas e de fungos, verificando que o óleo essencial da folha inibiu o crescimento de bactérias Gram-negativas como P.
aeruginosa ATCC 9027 e E. coli ATCC 10536 e ATCC 8733, sendo inativo
contra P. aeruginosa ATCC 25853, S. aureus ATCC 25923 e S. epidermidis ATCC 12228.
Já o óleo essencial do caule inibiu o crescimento das bactérias Gram positivas S. aureus e S. epidermidis e Gram negativas P. aeruginosa e E.
coli. A atividade antifúngica contra leveduras do gênero Candida para os
óleos essenciais da folha e do caule foi determinada utilizando-se linhagens de C. albicans ATCC 90028, C. albicans LM 105, C. tropicalis ATCC 13803,
C. tropicalis LM 14, C. krusei ATCC 6538, C. krusei LM 12 (MIRANDA, 2012).
Tanto o óleo essencial da folha quanto do caule de C. tricolor inibiram o crescimento das linhagens, com concentração inibitória mínima (CIM) de β56 μg.mL-1 para o óleo do caule e de 1β8 μg.mL-1 para o óleo da folha
(MIRANDA, 2012).
das folhas do C. tricolor contra linhagens de bactérias Gram negativas de E.
coli e Gram positivas de S. aureus. O óleo essencial das folhas de C. tricolor
demonstrou efeito bacteriostático, com concentração inibitória mínima (CIM) variando entre 6,7 mg.mL-1 e 1,67 mg.mL-1.
Neste estudo, foi avaliado a atividade antibacteriana do óleo essencial do caule de C. tricolor (Ct-OEc), onde determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM). Verificou-se que 5 das 8 linhagens avaliadas, E. coli ATCC 2536, E.
coli, ATCC 8539, E. coli 101, E. coli 105 e S. aureus ATCC 25925, foram
inibidas pelo Ct-OEc na concentração de 1 mg.mL-1 (CIM). Esse resultado
corrobora os de Miranda (2012) que demonstrou atividade antibacteriana do óleo essencial do caule de C. tricolor contra linhagens de S. aureus e E. coli.
As bactérias Gram positivas são normalmente mais sensíveis a antibióticos do que as bactérias Gram negativas (MADINGAN; MARTINKO; PARKER, 2004). A membrana externa das bactérias Gram negativas é uma barreira que dificulta a entrada de várias moléculas de antibióticos e o espaço periplasmático contém enzimas que são capazes de degradar moléculas vindas de fora da célula. Além disso, o antibiótico que atua sobre bactérias Gram positivas e Gram negativas, denominados de amplo espectro, têm uma maior aplicação médica do que aqueles que atuam apenas sobre um grupo de micro organismos (HOLETZ et al., 2002).
O Ct-OEC inibiu o crescimento tanto de bactérias padrão quanto de bactérias de origem clínica que normalmente são mais resistentes devido a pressão seletiva exercida pelo uso indiscriminado de agentes entimicrobianos (HOEFLER et al., 2006).
Não existe correlação entre o nível de inibição aceitável para os produtos naturais quando comparados aos antibióticos utilizados na clínica médica, tanto que alguns autores consideram somente resultados similares aos dos antibióticos, enquanto outros consideram promissores aqueles com níveis de inibição superiores. Aligianis et al. (2001), propuseram uma classificação para materiais vegetais com base nos resultados de CIM que considera como: inibição forte - CIM até 500 µg/mL, inibição moderada – CIM
entre 600 e 1500 µg/mL e inibição fraca – CIM acima de 1600 µg/mL.
Os valores da CIM do Ct-OEc obtidos neste estudo e os observados por Miranda (2012) e Ferreira (2014) foram diferentes o que pode ser explicado pela utilização de diferentes partes da planta, diferentes linhagens bacterianas e fatores ambientais que podem influenciar na composição química do óleo e consequentemente no seu efeito.
Neste estudo foi observado o efeito bactericida do Ct-OEc sem ocorrência de lise celular, entretanto vários óleos essenciais conferem atividade antibacteriana por danificar a parede celular e a membrana, levando à lise celular, perda de conteúdo celular, e inibição da bomba de prótons (BURT, 2004). A hidrofobicidade, uma importante característica dos OEs e seus componentes, lhes permite interagir com os lípidos da membrana celular e mitocôndrias, perturbando as estruturas e tornando-as mais permeável (KNOBLOCH et al., 1986; SIKKEMA; De BONT; POOLMAN, 1994). Embora a perda de uma certa quantidade de material celular possa ser tolerada sem perda de viabilidade, a perda grande do conteúdo das células ou a saída de moléculas e íons críticos irá conduzir à morte (DENYER; HUGO, 1991).
Durante as atividades celulares normais, vários processos dentro das células produzem espécies reativas de oxigênio. A formação de ERO é uma conseqüência natural do metabolismo aeróbico e faz parte do processo de manutenção da homeostase de oxigênio nos tecidos (SEIFRIED et al., 2007; CASTRO; FREEMAN, 2001).
Espécies reativas de oxigênio apresentam um paradoxo em sua função biológica: por um lado, eles previnem doenças, auxiliando o sistema imunológico, mediando a sinalização celular, desempenhando um papel essencial na apoptose. Por outro lado, eles podem danificar importantes macromoléculas nas células e podem ter um papel na carcinogênese e doença cardiovascular (SEIFRIED et al., 2007).
O equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes constitutivos - homeostase de oxigênio - é mantido através de uma série natural de reações
de oxidação-redução (redox) que envolvem a transferência de elétrons entre duas espécies químicas: compostos que perdem elétrons (oxidado) e aqueles que ganham elétrons (reduzido) (SEIFRIED et al., 2007).
A geração de radicais livres ocorre, sobretudo, nas mitocôndrias, membranas celulares e no citoplasma, e o seu alvo celular (proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA) está relacionado com o seu sítio de formação (BARBOSA et al., 2010, ANDERSON, 1996; YU; ANDERSON, 1997).
Espécies reativas de oxigênio desempenham um papel crucial nos processos fisiológicos normais, incluindo a resposta a fatores de crescimento, a resposta imune, e eliminação apoptótica de células danificadas (SEIFRIED et al., 2007).
Quando a homeostase de oxigênio não é mantida, o ambiente celular se apresenta em estresse oxidativo (SEIFRIED et al., 2007). O estresse oxidativo ocorre quando a produção de espécies reativas de oxigênio excede a capacidade das defesas antioxidantes celulares para remover estas espécies tóxicas (LIMÓN-PACHECO; GONSEBATT, 2009). As ERO são constituídos principalmente pelo radical superóxido (O2•), peróxido de
hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (•OH). Quando os mecanismos de
proteção antioxidante se tornam ineficientes por fatores diversos, pode ocorrer a deterioração das funções fisiológicas, aumentando a liberação das EROs no organismo, resultando em doenças e aceleração do envelhecimento (OLIVEIRA, 2011).
O organismo humano está sujeito ao estresse oxidativo causado por ERO e ERN provenientes do meio ambiente ou geradas pelo próprio organismo (BARREIROS; DAVID, 2006).
A formação de radicais livres, in vivo, ocorre via ação catalítica de enzimas, durante os processos de transferência de elétrons que ocorrem no metabolismo celular e pela exposição à fatores exógenos, tais como: xenobióticos, radiações ionizantes, metais pesados, tabagismo e ingestão de álcool. Estes fatores exógenos agem sobre a geração de radicais livres, bem como sobre a atuação dos sistemas de defesa antioxidante (BARBOSA et al.,
2010; BIANCHI; ANTUNES, 1999).
Para combater o excesso desses radicais livres no organismo, é necessário a ação de antioxidantes, que podem ser produzidos pelo corpo ou absorvidos da dieta (BARREIROS; DAVID, 2006). O sistema de defesa antioxidante tem a função de inibir e/ou reduzir os danos causados pelos radicais livres ou as espécies reativas não-radicais (BARBOSA et al., 2010). Esse sistema de defesa antioxidante é formado por antioxidantes enzimáticos (catalase, glutationa-peroxidase, superóxido dismutase) e não enzimáticos (glutationa, tióis, algumas vitaminas e metais, ou fitoquímicos tais como isoflavonas, polifenóis e flavonóides) (SEIFRIED et al., 2007).
A atividade antioxidante dos óleos voláteis tem sido bastante estudada (MANTLE et al., 1998; RUBERTO; BARATTA, 2000) e os óleos essenciais de plantas do Nordeste brasileiro constituem fontes potenciais de antioxidantes naturais (CATUNDA JUNIOR; LUCIANO; MORAIS, 2002).
A vegetação xerófila característica é afetada pela longa e irregular seca, altas temperaturas e elevada radiação ultravioleta (DESMARCHELIER et al., 1999). Nas plantas, a síntese de metabólitos secundários antioxidantes que absorvem em 300-400 nm é significantemente aumentada por radiação UV (GOTTLIEB; KAPLAN; BORIN, 1996) fornecendo, portanto, um alto nível de proteção contra oxidantes prejudiciais gerados termicamente ou pela luz (LARSON, 1988).
Morais et al. (2006b), avaliou a atividade antioxidante de espécies do gênero Croton do nordeste brasileiro, demonstrando a presença de atividade antioxidante das três espécies: C. zenhtneri, C. argyrophylloides e o C.
nepetaefolius.
Ferreira (2014), demostrou o efeito protetor do óleo essencial das folhas do C. tricolor contra a ação oxidativa da fenilhidrazina, um reconhecido agente oxidante. Verificou que o óleo essencial das folhas do C. tricolor reduziu significativamente o nível de metahemoglobina formada após a exposição à fenilhidrazina e portanto apresentou atividade antioxidante maior que a vitamina C, um comprovado agente antioxidante.
Neste estudo, foi avaliada, pela primeira vez, a atividade oxidante e antioxidante do óleo essencial do caule de C. tricolor frente à fenilhidrazina, que promove a desnaturação oxidativa da hemoglobina, e verificou-se que este não apresenta efeito oxidante nas concentrações testadas e apresentou efeito antioxidante na concentração de 1000 μg/mL, sendo capaz de reduzir a formação e metahemoglobina.
Propriedades antioxidantes também desempenham um papel fundamental em algumas das atividades biológicas dos óleos essenciais o que se justifica pelo envolvimento do estresse oxidativo em patologias (VALGIMIGLI et al., 2000). Estes atributos são devidos à capacidade inerente de alguns dos seus componentes, em particular fenóis, para parar ou retardar a oxidação aeróbica de matérias orgânicas, embora o procedimento através do qual o óleo é obtido a partir de matéria-prima (destilação) limita o conteúdo de compostos fenólicos na matriz final, porque muitos desses compostos não são voláteis (VALGIMIGLI, 2012).
Antioxidantes são considerados nutracêuticos importantes por causa de muitos benefícios à saúde (DROGE, 2002; LEE; KOO; MIN, 2004; VALKO et al., 2007).
A capacidade antioxidante de um extrato de produto natural dependerá essencialmente da biodisponibilidade da mistura específica dos compostos presentes, das suas interacções sinérgicas para se obter a resposta antioxidante final ao nível celular (LÓPEZ-ALARCÓN; DENICOLA, 2013).
Um bom antioxidante não é apenas um bom captador de radicais e composto redutor, mas uma molécula que pode exercer sua atividade antioxidante através da ativação de fatores transcricionais que induzem a expressão de enzimas antioxidantes, e assim, melhorando o estresse oxidativo (JONES, 2006).
A idéia por trás suplementação antioxidante é restaurar estado redox celular e dessa forma proteger contra os danos causados pelo estresse oxidativo, todavia, estudos têm indicado que a sobrecarga de compostos
redutores pode influir negativamente nas funções celulares normais e, dessa forma, ter efeitos nocivos à saúde humana (CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007).
As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais são utilizados para a produção de um grande número de fármacos (BELCAVELLO et al., 2012). O uso de preparações a base de plantas, ao contrário do senso comum, que as classifica como sendo naturais e isentas de reações adversas, podem apresentar vários agravos à saúde incluindo reações alérgicas, tóxicas, interações medicamentosas e efeitos mutagênicos (ERNST; PITTLER, 1998)
Devido ao grande número de componentes, os óleos essenciais parecem não ter alvos celulares específicos (CARSON; MEE; RILEY, 2002). Como lipófilos típicos, que passam através da parede celular e da membrana citoplasmática, afetam a estrutura das suas diferentes camadas de polissacárideos, ácidos graxos e fosfolípidos permeabilizando-os (BAKKALI et al., 2008).
Citotoxicidade é definida como o conjunto de alterações da homeostase celular, que leva a uma série de modificações, que interferem na capacidade adaptativa das células, bem como na sua sobrevivência, reprodução e realização de suas funções metabólicas (NARDONE, 1977).
Os testes de citotoxicidade in vitro são importantes para verificar a toxicidade de novos compostos nos estágios iniciais de desenvolvimento de fármacos (PUTNAM; BOMBICK; DOOLITTLE, 2002), pois o equilíbrio entre os efeitos farmacológicos e toxicológicos de um composto é um requisito importante, quando se está verificando sua aplicabilidade como agente terapêutico (MELO et al., 2000).
Os eritrócitos fornecem um modelo simples para estudar o efeito protetor ou tóxico de uma grande variedade de substâncias ou de situações associadas com o stress oxidativo (LEXIS; FASSETT; COOMBES, 2006; EISELE et al., 2006; MUÑOZ-CASTAÑEDA et al., 2006). Os efeitos hemolíticas dos compostos são avaliadas medindo a concentração de
hemoglobina no plasma após centrifugação e a ocorrência de hemólise pode ser diretamente correlacionada com o efeito tóxico das substâncias testadas (BRANDÃO et al., 2005).
O eritrócito é um tipo de célula que contém concentrações elevadas de ácidos graxos polinsaturados, de oxigénio molecular e íons ferro no estado ligado (NIKI et al., 1991). Por esta razão, pode-se esperar que sejam altamente vulneráveis a reações que envolvem radicais livres, e podem ser muito sensíveis à peroxidação lipídica da membrana celular e hemólise (BRANDÃO et al., 2005; BOSI et al., 2004; DEVASENA; LALITHA; PADMA, 2001; EL-MISSIRY; ABOU-SEIF, 2000). No entanto, estas células possuem um sistema antioxidante eficiente a nível citoplasmático que as torna extremamente resistentes a peroxidação quando os radicais são produzidos dentro da célula (CLEMENS; WAILER, 1987).
O teste da atividade hemolítica permite avaliar o potencial de uma substância em causar lesões à membrana plasmática da hemácia com consequente saída da hemoglobina que livre no plasma é prejudicial a saúde causando sérios danos em órgãos vitais como fígado, rins e coração (CARVALHO et al., 2007).
Não há relatos na literatura de estudos que avaliaram a citotoxicidade do óleo do caule de Croton tricolor, sendo este trabalho pioneiro na determinação da citotoxicidade frente a hemácias humanos.
A avaliação da atividade hemolítica de óleo essencial do caule de C.
tricolor frente a hemácias dos grupos sanguíneos A, B e O demonstrou
atividade citotóxica de baixa a moderada até a concentração de 100 μg/mL. Esses dados diferem dos obtidos por Ferreira (2014) utilizando óleo essencial das folhas de C. tricolor que observou uma baixa toxicidade em uma concentração de até três vezes mais alta.
O Ct-OEc apresentou maior efeito hemolítico e consequente citotoxicidade em hemácias do tipo sanguíneo B (75%) quando comparado com os tipos sanguíneos A (70,6%) e O (58,5%) que pode ser devida a presença de diferentes antígenos N-acetil-galactosamina (sangue tipoA) e D-
galactose (sangue tipo B) na superfície da hemácia que modificam a biointeração assim como o efeito.
Toxicologia genética é o estudo dos efeitos adversos sobre o processo de hereditariedade. Estudos de toxicologia genética têm dado origem a uma série de procedimentos teste para avaliar os efeitos de substâncias químicas sobre os mecanismos genéticos e o consequente risco para os organismos, incluindo os seres humanos (KRISHNA; HAYASHI,
2000).
Os estudos de genotoxicidade desempenham um papel importante no desenvolvimento de novos fármacos (GOLLAPUDI; KRISHNA, 2000; HARTMANN et al., 2001; KISKINIS; SUTER; HARTMANN, 2002), devendo ser realizados nos estágios iniciais desse desenvolvimento a fim de determinar uma potencial atividade genotóxica e/ou carcinogênica assim como para auxiliar na obtenção de novas estruturas químicas menos tóxicas (GOLLAPUDI; KRISHNA, 2000; SNYDER; GREEN, 2001).
Ensaios de genotoxicidade são ferramentas importantes para o estudo da genotoxicidade e da potencial carcinogencidade de agentes químicos ou físicos, podendo ser avaliadas tanto por testes in vivo quanto in
vitro tais como: teste do micronúcleo (SCHMID, 1975), teste de Ames (AMES;
McCANN; YAMASAKI, 1975), ensaio Cometa (TICE et al., 2000), entre outros.
No “Guia para a condução de estudos não clínicos de toxicologia e segurança farmacológica necessários ao desenvolvimento de medicamentos” (BRASIL, 2013), estabelecido pela ANVISA – MS, estão incluídos estudos de genotoxicidade in vitro e in vivo, utilizando bactérias e células de roedores e de mamíferos, entre os quais a avaliação in vivo do dano cromossômico em células hematopoiéticas de roedores (teste do micronúcleo) (BRASIL, 2004).
O teste do micronúcleo é concebido primariamente para avaliar a capacidade dos agentes testados para induzir dano cromossômico estrutural (clastogenicidade) e/ou numérico (aneugenicidade). Ambos os tipos de danos estão associados com o aparecimento e/ou progressão de tumores, e com resultados reprodutivos e de desenvolvimento adversos (KRISHNA;
HAYASHI, 2000).
A avaliação da frequência de micronúcleos in vivo é o teste primário em uma bateria de testes de genotoxicidade e é recomendado pelos órgãos reguladores em todo mundo como parte da avaliação de segurança do produto (KRISHNA; HAYASHI, 2000).
Neste trabalho, avaliou-se o potencial clastogênico e aneugênico pelo teste do micronúcleo em roedores in vivo, onde verificamos que o Ct-OEc não provocou o aumento da frequência de micronúcleos no sangue periférico de camundongos albinos (Mus musculus), linhagem Swiss, indicando que não apresenta efeito genotóxico.
Estudos sobre genotoxidade de espécies do gênero Croton através do teste do micronúcleo têm revelado ausência de genotoxicidade das espécies estudadas: Croton cajucara, (RODRIGUES et al 2010), óleo essencial das folhas de Croton tricolor (FERREIRA, 2014).
Considerando-se os resultados dos ensaios biológicos do óleo essencial do caule de Croton tricolor Klotzsch ex Baill (Ct-OEc), os quais mostraram a presença de boa atividade antibacteriana, ausência de atividade oxidante e presença de atividade antioxidante, citotoxicidade de baixa a moderada e ausência de efeitos clastogênicos e aneugênicos in vivo, mais estudos serão necessários para avaliar o potencial do Ct-OEc para o desenvolvimento de um futuro fitoterápico.