II) PATOLOGIA CLÍNICA INVESTIGAÇÃO
II.4) DISCUSSÃO
No geral, as colorações do tipo Romanowsky são a base para diagnosticar/suspeitar de infeções fúngicas durante a análise citológica [52]. No entanto, devido a diferentes afinidades dos
componentes das estruturas fúngicas para a coloração de rotina, poderá ser necessário a utilização de GMS e PAS para melhor avaliação da morfologia e confirmação do diagnóstico de infeção fúngica [49]. Neste estudo, comprovamos que as colorações PAS e GMS podem ser aplicadas
diretamente a amostras citológicas previamente coradas sem necessidade de descoloração, como tinha sido anteriormente publicado [39].
Os resultados obtidos permitem-nos concluir que, no caso do PAS, há uma maior afinidade de coloração da parede celular dos esporos/leveduras e uma afinidade variável no caso das hifas, o que confirmar resultados previamente publicados [49]. Esta ocorrência poderá dever-se à presença
de uma maior espessura da parede celular das hifas, o que poderá dificultar a sua coloração [43].
Corroborando estudos prévios, verificamos que o GMS marcava quer o interior, quer a parede do fungo, contribuindo para uma melhor identificação da morfologia celular [24; 25; 38; 49]. Apesar do GMS
marcar em média mais estruturas do que o PAS, verificou-se também que ocasionais estruturas PAS positivas eram negativas para a coloração GMS. A possibilidade de discrepância na afinidade das estruturas fúngicas para o PAS e para o GMS, justifica a recomendação para a utilização sequencial das duas colorações (e não de uma apenas) em amostras com suspeita microscópica de fungos [38].
As colorações de PAS e GMS permitem de modo significativo visualizar mais estruturas fúngicas e uma melhor discriminação da sua morfologia, o que poderá ser relevante para amostras com o baixo número de fungos ou com estruturas mal definidas (cuja origem fúngica não possa ser completamente descartada) na coloração de rotina. Num dos casos incluídos neste estudo, ambas as colorações especiais, mas especialmente o GMS permitiu identificar pseudohifas (as quais não eram visíveis na coloração de rotina), pelo que foi possível suspeitar do provável agente etiológico envolvido. A presença de pseudohifas em associação com leveduras e hifas é característico de
Candida albicans, um fungo considerado polimórfico [47; 49]. Esta observação reforça a importância
das colorações PAS e GMS na avaliação citológica de amostras com suspeita clinica ou microscópica de infeção fúngica, levando a hipótese de que estas colorações possam ser constituir um importante exame auxiliar para a identificação da espécie de fungo envolvida no processo patológico. Esta hipótese deverá ser confirmar em estudos futuros com um maior número de casos.
Figura 9 - Exemplo da aplicação das colorações sequenciais em dois casos distintos contendo hifas (A, B e C) e esporos
(D, E e F). Em (A) e (D) preparações citológicas com coloração Romanowsky; em (D) e (E) as mesmas áreas com a coloração PAS; e em (C) e (F) as mesmas áreas com a coloração de GMS. Barra = 20 µm.
Uma das dificuldades metodológicas neste estudo foi a identificação dos campos nas preparações digitalizadas coradas com GMS. Esta dificuldade estava relacionada, conforme já referido, com o baixo contraste entre citoplasmas e núcleos que o corante verde-luz permitia. Numa preparação extra de um dos casos o verde-luz foi substituído por hematoxilina (dados não apresentados). Esta alteração permitiu uma melhor distinção dos eritrócitos e das células inflamatórias, pelo que antecipamos que possa facilitar também a identificação de campos e, neste sentido resolva esta dificuldade prática.
Apesar dos resultados promissores relativamente à utilização sequencial das colorações PAS e GMS em preparações citológicas com fungos, este estudo apresenta também limitações. Uma dessas limitações é que nas amostras utilizadas não havia confirmação microbiológica e/ou molecular das espécies fúngicas envolvidas. Além disso, o número de amostras utilizado é reduzido,
C B
A D
E
semelhantes aos existentes na Medicina Humana, que auxiliem no diagnóstico citológico de infeções fúngicas em animais [43].
Figura 10 – Caso citológico de um cão onde foram aplicadas sequencialmente as três colorações. Em (A) observa-se a
presença de uma estrutura compatível com hifa (seta branca) fagocitada por um macrófago, Diff-Quik. Em (B) verifica-se que a mesma estrutura de (A) é na realidade uma pseudohifa (seta preta), PAS. Em (C) observa-se um maior numero de estruturas fúngicas: pseudohifas (seta amarela), esporos (cabeça de seta) e hifas verdadeiras, a maioria das quais não estão coradas pelo PAS, GMS. Há presença de alguns artefactos (i.e. grãos de pó de talco) nas 3 imagens, assinalados
A B C
*
*
*
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Anexos I: Tabelas
Outros (Hiperplasia, Negativo para neoplasia…) 16 4.3
Calcinosis Cutis 2 0.5
N casos
(%)
Lesões benignas
Quistos 10 2.7
Lesão benigna de conteùdo queratinico 23 6.1
2.9 Eosinofílica 5 1.3 Mista 9 2.4
Inflamação
Tipos
Piogranulomatosa 48 12.8 Neutrofílica 26 7.0 Granulomatosa 11 Micobacterium 2 0.5 Actinomyces / Nocardia 4 1.1Agentes etiológicos
Coccos 12 3.2 Bastonetes 6 1.6 Clostridiose 1 0.3 Criptococcose 1 0.3 Fungos (hifas) 4 1.1 Esporotricose 1 0.3 Histoplasmose 1 0.3 Blastomyces 1 0.3 Coccidiose 1 0.3 Rinosporidium 1 0.3 Malassezia 6 1.6 Pseudomicetoma 1 0.3 Babesiose 1 0.3 Leishmania 2 0.5 Dirofilaria 3 0.8 Herpesvirus 1 0.3 Prototheca 1 0.3 Hepatozoon canis 1 0.3 Esgana 1 0.3Tabela 1 – Casuística do diagnóstico citológico na Facoltà di Medicina Veterinaria - Università degli Studi di Milano. Foram
Adenocarcinoma adrenocortical Feocromocitoma Epitelioma sebáceo
Timoma
Neoplasias com origem no folículo piloso Adenocarcinoma das gl. apócrinas dos sacos anais
Carcinoma escamoso Hepatocarcinoma Neoplasia indiferenciada Lipoma Mixoma Maligna
TOTAL
374
100
0.3 Melanoma Total 8 2.1Inconclusivo
37 9.9 Núcleos Livres Total 2 0.5 1 0.3 1Neoplasia
EpitelialHiperplasia / Adenoma sebáceo
1 0.3 17 2.7 10 2.7 Sarcoma indiferenciado Histiocitoma TVT Mastocitoma 4.5 39 10.4 3 0.8 Linfoma Plasmocitoma Sarcoma Histiocitário Neoplasia indiferenciada Células redondas Total 77 20.6 5 2 0.5 1 0.3 Células mesenquimais Benigna 27 7.2 24 6.4 Rabdomioma Lipossarcoma Osteossarcoma
Tumor da Parede Perivascular maligno Sarcoma Anaplásico Céls. Gigantes
Angiossarcoma 2 0.5 10 1 0.3 3 0.8 2 0.5 1.3 0.5 1 0.3 19 5.1 2 0.5 2 0.5 11 2.9 Maligna 26 7.0 5 1.3 8 2.1 7 1.9 2 5 1.3 1 0.3
Neoplasia de células basais Adenoma das glândulas perianais
(%)
N casos
7 1.9
6 1.6
Benigna 28 7.5
Tabela 2 – (Continuação) Casuística do diagnóstico citológico na Facoltà di Medicina Veterinaria - Università degli Studi
Células redondas Epiteliais Mesenquimatosas Núcleos livres
Celularidade Elevada Elevada
Tendencialmente de baixa celularidade devido à aderência celular à matriz;
tumores malignos podem conter elevada celularidade
Elevada
Distribuição celular Igualmente distribuída pela amostra
Apresentação em grupos; contudo, as células malignas podem perder
coesividade
Isoladas ou em agregados com matriz
Numerosos núcleos livres distribuídos livremente
Tamanho e forma celular
Pequenas a médias dimensões, geralmente com limites citoplasmáticos
definidos
Pequenas a grandes dimensões, geralmente com limites citoplasmáticos definidos, de forma redonda a poligonal. Formas cuboidais, colunares ou redondas
dependendo do tecido
Fusiforme, ovais ou estreladas, geralmente com
limites citoplasmáticos indistintos
Redondas a poligonais, com limites citoplasmáticos
indistintos
Outras características
sugestivas
Núcleo redondo a indentado
Formação de ácinos ou túbulos; diferenciação escamosa; células grandes
com citoplasma abundante; células aderentes
Presença de matriz extracelular eosinofílica; núcleos redondos a elípticos
Núcleo redondo a indentado
Número 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 Estruturas fúngicas Espécie (Canina
ou Felina) Raça Sexo Lesão
Modo de recolha de amostra
Esporos/Leveduras
C Pastor Alemão F Linfadenopatia sistémica PAAF Hifas (provável Aspergillus
spp.)
C Cocker Spaniel F Cavidade oral Brushing
Hifas e Esporos/Leveduras
C Dogue Argentino M Massa cutânea, zona abdominal PAAF Esporos/Leveduras
C Pastor Alemão F Osso femoral PAAF
Leveduras Cryptococcus
spp.
C Indeterminada M Massa abdominal PAAF Leveduras Cryptococcus
spp.
F Europeu Comum M Gânglio pré-escapular PAAF
Leveduras Cryptococcus
spp.
F Europeu Comum M Tumefacção nasal PAAF Leveduras Cryptococcus
spp.
F Europeu Comum F Massa cutânea interdigital PAAF
Leveduras Cryptococcus
spp.
F Europeu Comum F Tumefacção região supraorbitária PAAF Leveduras Cryptococcus
spp.
F Europeu Comum F Tumefacção nasal PAAF
Anexos II: Gráficos
Gráfico 1 – Casuística Geral de todos os casos citológicos observados num período de 9 semanas na Facoltà di Medicina
Veterinaria da Università degli Studi di Milano.
Gráfico 2 – Inflamações observadas nos casos citológicos observados num período de 9 semanas na Facoltà di Medicina
Gráfico 3 – Neoplasias epiteliais observadas nos casos citológicos observados num período de 9 semanas na Facoltà di
Medicina Veterinaria da Università degli Studi di Milano.
Gráfico 4 – Neoplasias mesenquimatosas observadas nos casos citológicos observados num período de 9 semanas na
Gráfico 5 – Neoplasias de células redondas observadas nos casos citológicos observados num período de 9 semanas