A pesquisa de produtos naturais vem despertando interesse nas últimas décadas
buscando a obtenção de novas drogas com menos efeitos colaterais e maior efetividade. As alternativas utilizadas para este fim são: desenvolvimento racional de novos compostos, descoberta na natureza de novos produtos com ação anticâncer ou alteração da estrutura molecular das drogas já existentes. O uso de substâncias provenientes das plantas tem se mostrado nos últimos anos uma fonte efetiva no tratamento de várias doenças e principalmente o câncer. Estes produtos isolados servem muitas vezes como protótipos de novas drogas após alterações da estrutura química, o que pode torná-las mais potentes (CRAGG; NEWMAN, 2005).
A Calotropis procera Ait. f. tem sido usada ao longo dos anos com diversos fins, sendo conhecido o potencial terapêutico e tóxico de suas partes. Na Ayurveda, considerada a tradicional medicina indiana, ela está na lista das plantas, com efeito citotóxico (SMIT, 1995).
O presente trabalho avaliou a ação das várias partes aéreas (flor, fruto, folha, semente) da Calotropis. procera Ait. f., in vitro (MTT e ouriço do mar) com as frações do extrato hidroalcoólico: hexano, diclorometano, e N-butanol, testados em 5 linhagens de células HL- 60 (leucemia promielocítica), CEM (leucemia linfocítica), MCF-7 (carcinoma de mama), HCT-8 (carcinoma de cólon) e B-16 (melanoma murino).
Posteriormente, foi avaliada a ação do extrato etanólico do caule da Calotropis
procera Ait f.,. in vitro (MTT, ouriço do mar e teste hemolítico) com as frações hexânico,
diclorometano, acetato de etila, acetona e extrato metanólico, sendo realizado em quatro linhagens de células: HL-60 (leucemia promielocítica), CEM (leucemia linfocítica), HCT-8 (carcinoma de cólon) e B-16 (melanoma murino). O estudo in vivo destas frações foi realizado em camundongos com tumor sarcoma 180 tratados via intra-peritonial; Além disso, os camundongos com tumor de Ehrlich foram tratados com a fração metanólica por via oral.
Modelos celulares são ferramentas úteis e necessárias para estudar o potencial citotóxico de um composto, traduzido, inicialmente, por sua capacidade de induzir a morte celular. Foi observado que tanto as frações dos extratos hidroalcoólicos como os orgânicos de
50
Calotropis. procera Ait. f., apresentaram atividade citotóxica para o teste do MTT com CI50
menor que 11,0 g/mL (Tabela 3). Estes resultados estão de acordo com os achados de SMIT, 1995, que demonstrou que o estudo do extrato etanólico das flores de Calotropis. procera Ait. f. evidenciou importante efeito citotóxico, com uma CI50 de 1.4 g/mL em carcinoma de
cólon 320 (humano) bem como o estudo realizado por QUAQUEBEKE em 2005, que avaliou 57 linhagens de células de câncer humano através do MTT, após isolamento de um composto, o 2”- oxovoruscharin, novo cardenolide identificado na raiz da Calotropis procera evidenciando potente efeito anticâncer, equivalente ao taxol e superior ao irinotecan.
Contudo as frações hexano e diclorometano não demonstraram citotoxicidade para HL-60, CEM, Melanoma B-16 (murino) e HCT-8, com CI50 > 25 g/mL, sendo este resultado
foi oriundo possivelmente da baixa solubilidade destes dois extratos na solução diluente (Dimetilsulfóxido). Já o extrato metanólico, mostrou baixa atividade citotóxica apenas para a linhagem Melanoma-B-16 (murino) com CI50 > 25 g/mL, porém ALI, 2001 considerou o
extrato etanólico das folhas da C .procera potencialmente citotóxico frente a linhagem de células FL (linhagem de células epiteliais amniótica humana) com CI50 foi de 31 g/mL.
O teste do ouriço do mar tem como objetivo avaliar a citotoxicidade dos extratos, usando metodologia simplificada. O ensaio com ovos de ouriço do mar é um modelo alternativo que dispensa qualquer meio de cultura especial ou equipamentos sofisticados, sendo amplamente utilizado em estudos com drogas para avaliar efeito citotóxico, teratogênico e antitumoral (JACOBS et. al.,., 1986).
Como ocorre nas células tumorais, os ovos dividem-se rapidamente e apresentam uma sensibilidade seletiva a certos tipos de drogas com potencial antitumoral. A inibição da divisão celular pode estar relacionada a vários eventos, envolvidos no processo como: síntese de ácidos nucléicos, (DNA e RNA), síntese protéica e polimerização de microtúbulos. No bioensaio do ouriço do mar esses processos podem ser avaliados individualmente o que pode sugerir o mecanismo de ação da substância testada (FUSETANI, 1987).
51 Os extratos hidroalcoólicos e orgânicos testados apresentaram inibição desde a primeira divisão, porém as frações oriundas dos extratos orgânicos apresentaram maior efeito inibitório em todas as fases de divisão com CI50 menor que 5,0 g/mL (Tabela 4). Compostos
que inibem a síntese de DNA podem mostrar efeito desde a primeira clivagem, quando há um pico na produção de DNA (HAMMEL et. al.,., 1995). Outra alteração da síntese de DNA está relacionada ao retardo do desenvolvimento e surgimento dos blastômeros (FUSETANI, 1987).
A síntese de RNA, por sua vez não ocorre nas primeiras divisões celulares, sendo todo o RNA utilizado na síntese protéica proveniente do gameta feminino (BRANDHORST, 1985). Medicamentos como actinomicina D, que bloqueiam este processo, inibem o desenvolvimento embrionário do ouriço, a partir do estágio de mórula, quando o RNA é sintetizado (FUSETANI, 1987). A ação da actinomicina D, liga-se ao radical guanina do DNA o que bloqueia a ação da RNA polimerase impedindo a transcrição do DNA (CALABRESSI et. al., 2001).
Compostos que atuam no fuso mitótico inibem a partir da primeira clivagem. Substâncias como a citocalasina B afetam a polimerização dos microfilamentos e induz ao aparecimento de embriões unicelulares polinucleados o que sugere que houve duplicação do núcleo sem divisão do citoplasma (FUSETANI, 1987).
Pelos dados obtidos deste trabalho é provável que o possível mecanismo de ação dos extratos: hidroalcoólico e orgânico da Calotropis. procera Ait. f. esteja envolvido em alguma das etapas de duplicação celular.
Para verificar se a citotoxicidade sobre as células tumorais está envolvida com a lise da membrana plasmática um ensaio de atividade hemolítica foi realizado usando eritrócitos de camundongos que guardam semelhança com os eritrócitos humanos principalmente quanto à sensibilidade (COSTA-LATUFO et. al., 2002).
A estabilidade mecânica da membrana do eritrócito é um bom indicador dos efeitos de vários graus de lesão in vitro por vários compostos para demonstração de citotoxicidade e é dependente de propriedades físicas e estruturais da membrana (SHARMA, 2001).
52 Neste Trabalho avaliou-se a atividade hemolítica dos 5 extratos orgânicos (acetato , acetona, metanólico, hexânico e diclorometano) testados em eritrócitos de camundongos que mostraram capacidade hemolizante no intervalo de concentrações testadas: de 3,9 a 1000 g/mL (Tabela 7).
Os resultados deste estudo evidenciaram que as frações: acetato de etila apresentou maior lesão eritrocitária, seguido do metanol e acetona, já o hexano e o diclorometano não apresentarão ação hemolítica. A ação das três primeiras frações sugerem um possível mecanismo de ação por dano a membrana celular, o que corrobora com os achados de SHARMA 2001, que apresentou um estudo com extrato etanólico (flor, raiz, botão, galho, folha ) e acetato (folha e flor) onde avaliou a ação hemolítica da Calotropis. procera Ait. f. evidenciando ação com 0,5mg/mL (SHARMA, 2001).
O trabalho avaliou atividade antitumoral in vivo das frações dos extratos orgânicos: diclorometano (200 mg/kg), acetato de etila,(250 mg/kg) acetona (250 mg/kg), metanol (200 mg/kg, 400 mg/kg e 500 mg/kg) e 5-FU como controle positivo (50 mg/kg). A avaliação foi feita em camundongos Mus musculus Swiss transplantados com Sarcoma 180 (tratamento por via intraperitoneal). As frações obtidas, em diferentes solventes, do extrato do caule de
Calotropis. procera Ait. f., mostraram inibição dos tumores quando comparados ao controle.
Observou-se que a fração diclorometano apresentou percentual de inibição de 16,6%. O extrato acetato de etila mostrou um percentual de inibição em torno de 64,3% enquanto para o extrato acetona o percentual foi em torno de 53,1%, o extrato metanólico nas doses de 400 mg/kg e 500 mg/kg, apresentou percentual de inibição de 47,1%; metanol 500 mg/kg apresentou percentual de inibição de 49,7% e metanólico 200 mg/kg não apresentou inibição significativa. O controle positivo 5-FU apresentou percentual de inibição de 96,5% (Tabela 8).
Os resultados acima sugerem que todas as frações apresentaram inibição tumoral, sendo que os extratos acetato de etila, acetona (250 mg/kg) e metanol (400 e 500 mg/kg) apresentaram uma redução significativamente estatística com p<0.05 (Tabela 8, Figura 15).
53 A avaliação da atividade antitumoral in vivo via oral, do extrato metanólico (500 mg/kg) em camundongos Mus musculus Swiss transplantados com carcinoma de Ehrlich, mostrou inibição do crescimento tumoral de 43,18% quando comparado ao controle negativo, salina, (Tabela 9, Figura 16) .
AKINLOYE, 2002 em estudo histopatológico de órgãos reprodutores masculinos de ratos tratados com extratos de folhas frescas de Calotropis. procera Ait. f. (20 mg/g) observou alterações na estrutura celular testicular, principalmente em animais tratados por períodos mais prolongados. Já em 1979 GARG estudando ratos expostos ao extrato de flores da
Calotropis. procera Ait. f. por um período de 30 dias, observou alterações degenerativas
graves das células de Sertoli. Esses dados corroboram com nossos achados, sugerindo que extratos de partes aéreas de Calotropis. procera Ait. f. demonstram atividade citotóxica, principalmente em células que apresentam elevado índice mitótico.
As análises histopatológicas dos órgãos removidos dos animais tratados sugerem que o fígado pode ser considerado como alvo potencial da toxicidade dos extratos orgânicos: acetato de etila, acetona (250 mg/kg - via intraperitoneal) e metanol (500 mg/kg - via intraperitoneal e oral). O extrato acetato de etila afetou o fígado, porém de forma menos intensa. As drogas podem ser consideradas causadoras de lesões em estruturas celulares quando administradas em pessoas ou animais, sendo estes achados, comprovados em biópsias. Muitas drogas com atividade antitumoral in vivo podem dar origem à lesões importantes em um determinado órgão alvo, assim como também, pode ocorrer com substâncias que apresentam estruturas químicas variadas e que diferem ocasionalmente e amplamente de suas ações farmacológicas (SCHEUER et. al., 2000).
Tumefação turva dos hepatócitos acompanhada por esteatose microvesícular em algumas áreas foram observadas nos animais tratados com os extratos acetato de etila, acetona (250 mg/kg - via intraperitoneal) e extrato metanólico (500 mg/kg - via intraperitoneal e oral), sugerindo hepatotoxicidade intrínseca., foi encontrado áreas de foco inflamatório tais Porém alterações são consideradas de caráter reversível, exceto quando ocorre um grande dano na estrutura do hepatócito (SCHEUER, 2000; KUMMAR, 2004; MCGEE et. al.,., 1992).
54 Nos animais do grupo controle, também foram visualizadas tumefação turva dos hepatócitos, áreas de congestão portal e da veia centrolobular e hiperplasia das células de Kupffer, sugerindo que estes efeitos estão relacionados ao metabolismo dos hepatócitos. Além disso, os animais tratados com 5-FU (via intraperitoneal) também apresentaram hiperplasia das células de Kupffer, o que sugere a toxicidade da droga (KUMMAR et. al., 2004).
Os extratos acetato de etila e acetona, administrados por via intraperitoneal mostraram ação nefrotóxica com áreas de hemorragia glomerular e tubular, onde o rim parece ser o maior alvo de toxicidade para estes dois extratos. No entanto, as alterações observadas nos animais tratados podem ser consideradas reversíveis (TISHER; BRENNER, 1994). Valendo salientar que o extrato metanólico não demonstrou ação nefrotóxica seja por via oral ou intraperitoneal.
Quanto à análise do tecido tumoral, os animais do grupo controle negativo apresentaram áreas de necrose de coagulação, sendo, provavelmente devido a hipóxia tecidual. Nos grupos tratados com os extratos orgânicos: acetato de etila, acetona (250 mg/kg - via intraperitoneal) e extrato metanólico (500 mg/kg - via intraperitoneal e oral), e 5-FU (50 mg/kg - via intraperitoneal) essas áreas devem-se provavelmente a atividade antitumoral (KUMMAR et. al.,., 2004).
Sendo assim, os dados obtidos nos ensaios in vivo confirmam o potencial anticâncer dos extratos orgânicos: acetato de etila, acetona e metanol obtidos da Calotropis. procera Ait. f., sugerindo que estes extratos apresentam potencial atividade antineoplásica. Entretanto os extratos testados parecem atuar de maneira direta, inibindo a síntese de DNA da célula tumoral, levando-a a morte, bem como sobre a lise da membrana plasmática, o que pôde ser observado pelo teste de atividade hemolítica.
Tanto a toxicidade in vitro, quanto in vivo demonstram um potente efeito dos extratos estudados, porém são necessários estudos mais detalhados para elucidar as substâncias responsáveis pelos efeitos tóxicos, pois a avaliação deu-se apenas em extratos, e não, em substâncias isoladas da Calotropis. procera Ait. f., devido a dificuldade de isolamento dos compostos bioativos.
55
6. CONCLUSÃO
A avaliação de frações oriundas dos extratos hidroalcoólico de partes aéreas (hexano, diclorometano e N-butanol) e etanólico do caule (hexano, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol), de Calotropis. procera Ait. f. apresentou elevado potencial citotóxico frente as linhagens de células tumorais testadas, bem como ambos os extratos inibiram de forma significativa a divisão celular em ovos de ouriço do mar, como também, foi demonstrado a ação hemolítica das frações obtidas do extrato etanólico. Quanto aos testes de atividade antitumoral in vivo, por via intraperitoneal em sarcoma 180, com as frações orgânicas acetato de etila, acetona e matanol como também por via oral em carcinoma de Ehrlich, com a fração metanólica, observou-se uma potente ação inibidora do crescimento tumoral para as frações estudadas.
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