A colecistopatia crônica calculosa é uma doença muito comum, e a colecistectomia, a cirurgia realizada com maior frequência pelo cirurgião do aparelho digestivo de maneira eletiva(69,70). A partir de relatos na literatura internacional e em nosso meio(20,24,26,27,30,31,71)
sobre o isolamento de espécies de Helicobacter na bile do fígado e particularmente da vesícula biliar e suas possíveis implicações na patogenia de doenças tanto inflamatórias como neoplásicas que, nos interessamos em avaliar a prevalência do Helicobacter spp nos doentes operados por colecistite crônica em nosso grupo.
Baseado em evidências de prováveis mecanismos patogênicos no processo inflamatório causado pelo Helicobacter na mucosa da vesícula biliar na colecistite crônica
(18,25,50-53) e de controvérsias sobre o bacilo ser o responsável por mudanças do epitélio
colunar da mucosa da vesícula(20,72-74), procuramos correlacionar a presença do Helicobacter spp e alterações histológicas consideradas atípicas na colecistite crônica calculosa.
Diferente de outras bactérias encontradas na bile na vigência de colelitíase há muita dificuldade em isolar e cultivar bacilos do gênero Helicobacter(9,17,25) , apesar do isolamento de bacilos viáveis no fígado em doentes com cirrose(75,76). Especula-se sobre a resistência da bactéria aos ácidos biliares(58). O êxito da cultura depende do método de colheita, do meio de transporte adequado, além do meio de cultura ideal. O organismo perde sua viabilidade rapidamente à temperatura ambiente razão pela qual orienta-se o transporte a pelo menos 4 ºC e em meio adequado(77). Para que um organismo seja considerado patogênico é necessário que respeite os postulados descritos por Koch(22) e o fato do Helicobacter isolado não crescer em meio de cultura puro se torna um obstáculo fundamental. Em nosso caso, após a colheita da bile, acondicionamos o material rapidamente a -20 ºC para evitar a desnaturação protéica e conservar os possíveis bacilos ali presentes. Não realizamos cultura do Helicobacter pela dificuldade descrita previamente e por não ser o tema deste trabalho.
Um dos questionamentos na literatura é se o achado de fragmentos de DNA de Helicobacter na PCR corresponderia a bactérias viáveis, se os bacilos seriam saprófitas, causariam doença, ou se são apenas fragmentos trazidos pelo sistema porta a partir do íleo e ceco até o sistema biliar(18,25,72,74). O fato de na maioria dos relatos isolar-se material genético de fragmentos pequenos de 400bp pelos métodos tradicionais de PCR, alguns autores sugeram que poderiam não se tratar de bactérias inteiras e sim fragmentos de
associada à grande fragmentação do DNA e, portanto, haveria menor chance de amplificação de fragmentos de 400pb. Paralelamente a isso, são visualizados no muco junto do epitélio colunar da vesícula ou mesmo na submucosa à microscopia óptica de maior aumento, bacilos flagelados espiralados de 2,5 a 4,0 µm sensíveis ao corante de Giemsa modificado, semelhantes ao H. pylori de biópsias gástricas e que quando analisados por imunohistoquímica demonstram ser bacilos do gênero Helicobacter em sua forma infectante(52). O fato de haver prevalência variada do Helicobacter spp tanto em populações de diferentes regiões como em grupos controle sem doença neoplásica ou litiásica da vesícula biliar, reforça a hipótese dos bacilos serem apenas saprófitas e não causarem doença(15-17).
Por estas considerações, resolvemos avaliar a presença do Helicobacter spp por visualização direta com microscopia óptica à semelhança a de biópsias gástricas, e através da PCR, métodos frequentemente utilizados na literatura.
Foram selecionados para compor a casuística, doentes operados eletivamente de colelitíase sintomática, tanto por via laparoscópica como convencional e que apresentassem colecistite crônica no anátomo-patológico. Foram excluídos, doentes com neoplasias e processos inflamatórios agudos, no intuito de selecionar melhor a casuística.
A presença de infiltrado inflamatório agudo, hemorragia, necrose poderia dificultar o isolamento de DNA da bile mais viscosa ou com secreção purulenta e a visualização de bacilos na microscopia. Há relatos na literatura de isolamento de DNA de Helicobacter em doentes com coledocolitíase, portanto, também foram excluídos aqueles com diagnóstico pré-operatório para evitar que fatores como colestase e colonização bacteriana em casos de coledocolitíase primária pudessem influir nos resultados(9,15). Doentes com uso prévio de antibióticos bem como bloqueadores de bomba de prótons que pudessem ter efeito bacteriostático quando utilizados no tratamento de erradicação do Helicobacter pylori no estômago(78). Os achados intra-operatórios eventuais de coledocolitíase (2,0%) e esteatose hepática (3,0%) não foram considerados como fatores para exclusão dos doentes, visto que não estavam associados à colestase (Tab. 1).
Na metodologia, a colheita da bile foi realizada por punção da vesícula antes da realização da antibioticoterapia profilática no intuito de se evitar qualquer efeito bactericida
ou bacteriostático da droga e, rapidamente colocada em frasco de eppendorf e acondicionado a -20 ºC para se evitar desnaturação do DNA.
As vesículas biliares foram enviadas para exame anátomo-patológico e histológico, realizados por um mesmo patologista e revisados por outro nos 100 doentes da casuística, a fim de diminuir erros na interpretação dos aspectos histológicos estudados.
Dos 100 casos inicialmente estudados, apenas 68,0% dos doentes da amostra apresentaram evidência de DNA após extração com QIamp DNA Mini Kit (USA. Qiagen Inc – Valencia, CA). É uma taxa de extração de material genético considerada como sendo baixa, achado este que nos fez questionar a eficiência do método utilizado. Porém vários fatores como viscosidade e ph da bile podem ter dificultado os processos de diluição e filtração em membrana nos frascos QIamp MinElute Column, após a desnaturação protéica com proteinase K(31,58). Discutiu-se que, a quantidade de bile coletada (dois a três ml) fosse pequena devendo-se ter aspirado todo o conteúdo vesicular e aumentado o volume de diluição e o tempo de centrifugação de todo o material para se conseguir melhores resultados.
A prevalência do Helicobacter spp em nossa casuística, excluídos casos onde não foram isolados material genético nem DNA humano, foi de 61,8% e na microscopia óptica a visualização de bacilos Giemsa positivos foi de 27,9%. É uma prevalência semelhante quando comparada a dados da população chilena e asiática, e mais elevada do que dados prévios de nosso meio(10,13,24-27,31). Talvez o achado possa estar relacionado ao fato de a população do estudo compreender doentes com processo inflamatório crônico, com cólica biliar em média de dois anos, excluindo-se doentes sem infiltrado inflamatório e colelitíase assintomática o que selecionou ainda mais a amostra. Vários autores relatam a associação e a capacidade do Helicobacter de gerar processo inflamatório (2,18,25,46,51,53) e atribuir ao Helicobacter isoladamente a inflamação seria uma conclusão simplista.
A comparação entre a sensibilidade do método direto de visualização à microscopia dos bacilos com a detecção molecular de fragmentos de gene de DNA bacteriano deve ser feita com cuidado. A opção por utilização da coloração de Wright-Giemsa modificado, descrita inicialmente para identificação e diferenciação de células em esfregaços de sangue ou medula óssea(64), foi pelo fato de ser um método prático, rápido e muito utilizado em análises de biópsias de mucosa gástrica para visualização de bacilos urease positivos
Outros métodos de coloração eficientes seriam o da carbofuscina simples e o laranja de acridina(55,56). O fato de encontrarmos formas cocóides e espiraladas na microsocopia sugere que os bacilos Giemsa positivos podem ter sido fixados ainda viáveis. Não foi possível realizar a imuno-histoquímica com anti-soro específico tipo CagA e VacA para Helicobacter pylori. Isto impediu a comprovação do gênero dos bacilos encontrados nos cortes histológicos, não sendo válido comparar a microscopia com a PCR no que diz respeito ao gênero de bacilo encontrado. Apenas 26,2% dos doentes que tinham bacilos à microscopia eram positivos para Helicobacter spp na PCR sugerindo que estes eram provavelmente do gênero Helicobacter (Tab. 4).
Interessante, no entanto, é que não se procurva até pouco tempo pela presença de bacilos na microscopia quando do exame histológico da vesícula biliar e em nosso estudo nos cortes histológicos padronizados foram encontrados bacilos no muco, em meio à mucosa do epitélio, em pequena e grande quantidade. O próximo passo será submeter lâminas arquivadas ao exame de imuno-histoquímica para identificação de bacilos da família Helicobacteriacea.
Uma crítica importante que pode ser realizada ao trabalho é o fato de não haver um grupo controle de vesícula biliar sem doença. Isso só seria possível com utilização de vesículas biliares de doentes doadores de transplante de fígado ou, submetidos a colecistectomia profilática em casos de obesidade mórbida, conduta nem sempre praticada.(31). Procuramos contornar este problema utilizando como comparação os doentes da casuística que não possuíam evidência à microscopia nem na PCR da presença de bacilos ou Helicobacter, visto que todos os doentes eram portadores de colecistite crônica calculosa com infiltrado linfo-plasmocitário o que conferia homogeneidade à amostra.
Conforme a Tabela 1, os grupos eram semelhantes e puderam ser comparados.
Quando analisada a presença de bacilos Giemsa ⊕ na microscopia com a presença de alterações histológicas atípicas como metaplasia ou presença de folículos linfóides (Tab.
2 e 5), houve correlação estatística em comparação aos doentes sem bacilos. Apesar de 12 (63,2%) dos 19 doentes Giemsa ⊕ possuírem alterações histológicas o número de casos onde os bacilos foram visualizados à microscopia óptica foi pequeno.
A presença de folículos linfóides é uma alteração histológica que pode estar relacionada a presença do Helicobacter spp à semelhança do desenvolvimento do linfoma MALT no estômago. Mesmo que não tenha havido correlação entre os dois métodos de micoscopia e o molecular para detecção do bacilo e que, nem todos os bacilos Giemsa ⊕ foram comprovados como sendo Helicobacter (Tab. 4), tal achado sugere que a presença das bactérias possa ser responsável pelo estímulo de linfócitos T e B e formação de clones de células para formar folículos linfóides(7,50,51,54). Encontramos uma média de idade de 57 anos para o aparecimento de folículos linfóides em relação aos doentes que não apresentaram tal condição, sugerindo que se o bacilo tiver papel determinante no desenvolvimento da colecistite folicular, o tempo de história de infecção que parece ser mais comum na infância é importante(14). O método de visualização direta é limitado no diagnóstico da presença do Helicobacter, em comparação à sensibilidade da PCR para detecção dos bacilos. Acreditamos que esta tenha sido a razão pela qual não foi encontrada relação com outras alterações histológicas como as metaplasias, demonstradas por outros autores(24,72).
Outro fator que pode ser analisado na falta de correlação entre os achados da microscopia e da PCR em relação à presença de bacilos é que, a pesquisa do Helicobacter spp no método molecular foi feita na bile e não no tecido. Os bacilos Giemsa ⊕ foram visualizados em meio ao muco, às células descamadas e na mucosa da vesícula biliar.
Caso tivéssemos pesquisado o Helicobacter em meio ao tecido pela PCR, poderíamos inclusive ter aumentado nossos dados de prevalência na população estudada. Vários trabalhos pesquisam a presença de Helicobacter spp tanto na bile, como na mucosa e até no próprio cálculo da vesícula biliar, encontrado incidências diferentes conforme a população estudada e método utilizado (10,15,24,27,30).
Mesmo não havendo significância estatística entre os doentes com PCR positiva 42 (61,8%), em relação aos casos de PCR negativa 26 (38,2%) quando comparados à presença de alterações histológicas atípicas na mucosa da vesícula biliar (Tab. 3), 24 (57,1%) doentes apresentaram metaplasia com ou sem folículos linfóides na histologia. É um número elevado de casos com alterações consideradas atípicas. Talvez a limitação da amostra seja um fator restritivo para a conclusão se a presença de fragmentos de Helicobacter spp possa determinar transformação no epitélio colunar da vesícula, ou mesmo, processo inflamatório.
presença de inflamação com ou sem litíase vesicular presente. Atribuir as alterações somente pela presença do Helicobacter seria um erro a princípio. Outras bactérias podem colonizar a bile da vesícula na presença de colelitíase e causar alterações inflamatórias tais quais a Escharichia coli, Salmonella typhi, entre outras (44,62). Os tipos de cálculo de colesterol, misto ou pigmentar podem estar relacionados ao processo inflamatório, principalmente o misto pela ação dos sais biliares irritantes crônicos da mucosa(9,15). O tempo de história de cólica biliar bem como, fatores químicos e genéticos não estudados neste trabalho são variáveis que interferem na elucidação do verdadeiro papel do Helicobacter na gênese das alterações do epitélio colunar da mucosa da vesicula biliar.
Porém, achados de maior incidência de espécies de Helicobacter associados a áreas de metaplasia da mucosa vesicular(73) e sua capacidade de estimular a proliferação celular(45) e gerar processo inflamatório(51), sugerem potencial de mudança do epitélio colunar da vesícula biliar.
Achados adicionais como tipo de cálculo, hemorragia, calcificações, fibrose e mesmo alterações como hipertrofia muscular, alterações consideradas benignas quando relacionadas com a presença ou não de bacilos ou DNA bacteriano não demonstraram correlação estatística (Tab. 6). A amostra é pequena e conforme citado, estudar todos estes fatores isoladamente seria possível apenas em animais de laboratório como ratos híbridos e propensos a desenvolver colelitíase(24) ou, em vesículas sem colelitíase ou processo inflamatório agudo(31).
O fato de não termos utilizado um grupo controle sem doença litiásica nos impediu de estudar a prevalência do Helicobacter nesta população de doentes e ter analisado se, isoladamente, o bacilo ou fragmentos da bactéria, seriam capazes de gerar processo inflamatório e alterações no epitélio da vesícula(31,50,53). Selecionamos da casuística um grupo de doentes que teoricamente não estariam colonizados pelo Helicobacter (grupo controle) e quando comparadas alterações histológicas e tipo de cálculo encontrados nos dois grupos de doentes com e sem bacilos, não houve correlação estatística (Tab. 7).
Achados como coledocolitíase, vesícula esclero-atrófica, pancreatite biliar e colesterolose são condições associadas à doença litiásica na sua forma de apresentação ou pelo seu tempo de história e apesar de em alguns trabalhos na literatura terem
pesquisado a presença do Helicobacter nesta população de doentes(9,15), não encontramos relação causal com tais condições nem maior prevalência da bactéria nesses doentes.
Em nosso trabalho, o que pudemos identificar é que no grupo de doentes com colecistite crônica calculosa sintomática, a prevalência do Helicobacer spp foi elevada.
Porém, pela metodologia empregada, não houve relação entre presença do bacilo e as alterações histológicas citadas na literatura como pré-neoplásicas ou mesmo à presença do bacilo.
Seguindo os postulados descritos por Koch(22), achamos aparentemente o microorganismo colonizando o organismo que sofre a doença. Não cultivamos este microorganismo pelos motivos já citados. Não sabemos qual a espécie de Helicobacter identificada e o próximo passo do estudo, através de sequenciamento genético, será reconhecer em sua escala filogenética o tipo de bactéria que coloniza a nossa população de doentes, como fizeram vários autores(13,51,59-63,79). Na literatura, as espécies entéricas de Helicobacter “não-pylori” encontradas no homem são: H. cinaedi, H. fennelliae, H. cannni, H. rappini, H. pullorum, H. canadensis(63). As espécies gástricas já isoladas foram o H.
pylori, H. heilmanni e H. felis(2). As espécies mais frequentemente encontradas colonizando a bile da vesícula biliar e do fígado foram o Helicobacter pylori, H. hepaticus e o H.
bilis(18,25,60). Identificar a espécie de Helicobacter tem importância epidemiológica e se, uma vez correlacionado seu papel na etiopatogenia das doenças da vesícula, tal conhecimento terá importância na prevenção da infecção, na erradicação e profilaxia de vetores animais.
Os prováveis mecanismos patogênicos dos bacilos causadores de doença litiásica e mesmo de tumores de vesícula biliar estão sendo exaustivamente estudados na literatura, principalmente em locais como o Chile, onde a doença é muito frequente.
Semelhante aos trabalhos com ratos híbridos de laboratório(24), será necessário inocular o agente infeccioso e avaliar se ele causa a doença em questão e depois isolá-lo novamente do organismo doente.
Portanto, há um longo caminho a ser percorrido no intuito de confirmar se o Helicobacter spp, devido a sua alta prevalência em doentes com colecistite crônica, é um organismo saprófita ou está realmente envolvido na etiopatogenia das doenças da vesícula biliar.