A difteria é uma doença cuja manifestação clinica resulta da ação de uma
toxina extracelular produzida pela bactéria Corynebacterium diphtheriae. A
imunização rotineira contra difteria foi introduzida nas décadas de 40 e 50,
levando a quase completa erradicação desta nos países desenvolvidos e na
Europa na década de 80. No entanto essa doença é endêmica em algumas partes
do mundo e desde 1980 algumas epidemias têm ocorrido na Europa. A mais
importante foi a que ocorreu na Rússia e na Ucrânia em 1994, onde a OMS
registrou 47.000 casos da doença e 1.700 mortes (WHO, 2009). As principais
razões para a epidemia na Europa têm sido a baixa cobertura da vacina, a
queda da imunidade em adultos e a movimentação de refugiados. É
recomendável, segundo a WHO, o reforço na vacinação de adultos. No Brasil a
difteria encontra-se sob controle: em 2001 foram registrados 19 casos e 3 mortes
e em 2008, nenhum caso (MS, 2009) (Figura 42). A situação de controle da
difteria no Brasil é conseguida com a manutenção de altas coberturas vacinais
com a vacina DPT em menores de um ano, e a revacinação com a vacina dupla
adulto (DT) a cada 10 anos. Para diminuir ainda mais a incidência dessa doença é
feito também o aprofundamento da situação de controle, por meio do
fortalecimento da vigilância epidemiológica e da elevação e homogeneidade das
coberturas vacinais em cada município (MS, 2009). Portanto, de um modo geral
A doença
Difteria e tétano são doenças bacterianas agudas e muitas vezes fatais,
nas quais a manifestação clínica não é devida a uma infecção invasiva, mas
devido à liberação de toxinas potentes que por sua vez causam os danos no
paciente. Por esta razão, ambas as doenças podem ser prevenidas pela presença
de anticorpos neutralizantes, que podem ser induzidos através de imunização
com as formas não tóxicas da toxina ou por imunização passiva (soro hiper-
imune, como é aquele produzido por cavalos imunizados).
Ramon, na França em 1924 (RAMON, 1924) e Glenny e Hopkins na
Inglaterra (GLENNY e HOPKINS, 1923) descobriram um método eficaz de
destoxificação das toxinas tetânica e diftérica através do tratamento com
formaldeído, o que permitiu a erradicação destas doenças nos países
desenvolvidos (RAPPUOLI, 1997). As vacinas contra difteria (D) e tétano (T)
continuam a ser preparadas até a atualidade através do método de
destoxificação descrito por Ramon (RAPPUOLI, 1997). Apesar de estas vacinas
serem efetivas, todas são de um baixo grau de pureza e têm sido associadas com
alguns efeitos colaterais indesejáveis. Conseqüentemente é relevante o
desenvolvimento tecnológico de vacinas mais avançadas, onde se purifique mais
o antígeno ao mesmo tempo em que se proponha um adjuvante mais potente
que o tradicional hidróxido de alumínio.
As vacinas D e T são geralmente associadas à vacina celular contra
pertussis (DTP). Em alguns países já se associam D e T a uma vacina acelular
contra pertussis. Entretanto têm sido observadas quedas de potência na vacina
acelular tripla (DTaP) uma vez que não se encontram aqueles componentes da
adjuvante para D e T. Torna-se, portanto relevante que se estude também um
método de se veicular estes antígenos para se aumentar a imunogenicidade (o
veiculo pode atuar também como adjuvante) e potência destas vacinas de
segunda geração.
Figura 42. Distribuição de casos confirmados de difteria no Brasil entre 1997 e 2006
(Sinan/SVS/MS, 2007).
Os métodos de vacinação parenteral que necessitam de agulhas, são
invasivos e, além disso, são rejeitados pela maioria dos pacientes. Os altos
custos de uma campanha de vacinação envolvem a necessidade de se ter pessoal
treinado e material descartável para se evitar o risco de contaminações como
AIDS e hepatite. As vacinas administradas através da via parenteral estimulam a
maneira não alcançam a superfície das mucosas que, por sua vez, são a porta de
entrada para a maioria dos agentes infecciosos com é o caso da difteria. A
imunização de mucosa é a primeira defesa imunológica (produção de IgA) que
prevê o ataque dos agentes infecciosos e previnem danos maiores ao organismo
(JAIN, SHARMA e VYAS, 2006; MEDINA e GUZMAN, 2000). Portanto a imunização
oral é o meio mais seguro e conveniente na indução de imunidade de mucosa.
Portanto é atual, relevante e desejável que se busque um adjuvante de
mucosa que seja também um bom veículo para antígenos como o toxóide
diftérico. Nesta tese, o veículo com propriedades adjuvantes estudado foi o
lipossoma. As vantagens do uso de lipossomas, por exemplo, como adjuvante e
transportador de vacinas é que vários antígenos podem ser associados a uma
mesma formulação (GREGORIADIS et alii, 1993). Com isto cópias múltiplas dos
antígenos são ―entregues‖ ao sistema imunológico de uma só vez. Entretanto, os lipossomas não resistem à ação dos sais biliares e das enzimas do trato
gastrointestinal reduzindo, portanto, o seu uso em veiculação de vacinas orais.
Mais recentemente, o desenvolvimento de uma partícula lipossomal resistente
ao sistema digestório passou pelo uso de quitosana como revestimento (MARÓN
et alii, 2007; GUZEY e McCLEMENTS, 2007; HARNSLAWAT, PONGSAWATMANIT e
McCLEMENTS, 2006; AOKI, DEKER e McCLEMENTS, 2005; GU, DEKER e
McCLEMENTS, 2005; KLINKERSON et alii, 2005a; 2005b; MERTINS et alii, 2005; WU
et alii, 2004; OGAWA, DEKER e McCLEMENTS, 2003; RENGEL et alii, 2002;
TACHEUCHI, YAMAMOTO e KAWASHIMA, 2001; FILIPOVIC-GRCIC, SKALKO-BASNET
e JALSENJAK, 2001). Parte do problema de estabilidade lipossomal, frente ao
meio biológico já é resolvida (MARÓN et alii, 2007; GUZEY e McCLEMENTS, 2006;
McCLEMENTS, 2005; GU, DEKER e McCLEMENTS, 2005; KLINKERSON et alii, 2005a;
2005b; MERTINS et alii, 2005; WU et alii, 2004; OGAWA, DEKER e McCLEMENTS,
2003; RENGEL et alii, 2002; TAKEUCHI, YAMAMOTO e KAWASHIMA, 2001;
FILIPOVIC-GRCIC, SKALKO-BASNET e JALSENJAK, 2001), mas, a estabilidade da
formulação quanto à possível agregação das partículas (MARÓN et alii, 2007) só
foi resolvida totalmente esclarecida e resolvida nesta dissertação, como será
discutido mais para frente. Outro obstáculo a ser vencido numa formulação
lipossomal através do método de formação de REVS (MARÓN et alii, 2007) era o
da estabilidade do toxóide diftérico frente à sonicação e ao solvente usado na
primeira fase da formação de vesículas.
A fase de formação da micela reversa (etapa 1-3, Figura 1) submete a
proteína às pressões altas; gradientes de temperaturas; forças de cisalhamento;
possibilidades de oxidação e à ação de radicais livres. Com o cisalhamento da
fase aquosa aumentam-se as interfaces hidrofóbicas (o que é uma grande
desvantagem do método, MERTINS et alii, 2005). Tudo isto pode levar à adsorção
da proteína, seguidas por desenovelamento e agregação, como o descrito para
métodos de emulsificação semelhantes (NAMUR et alii, 2009; PÉREZ-RODRIGUES
et alii, 2003; PÉREZ, DE JÉSUS e GRIEBENOW, 2002; MEINEL et alii, 2001; DIWAN
e PARK, 2001; CASTELLANOS et alii, 2002; WEERT et alii, 2000; SAH, 1999a; SAH,
1999b; XING et alii, 1996).
Ao longo dos últimos 30 anos foram descritos vários agentes protetores de
desnaturação de proteínas durante suas microencapsulações. O que ocorre na
literatura é a adição indiscriminada de agentes (BSA, sacarose, surfactantes não
iônicos e PEG) potencialmente estabilizantes sem haver uma definição com uma
estruturalmente protegendo (NAMUR et alii, 2009). Naturalmente, que a
estrutura da proteína praticamente definiria o uso do aditivo escolhido para
protegê-la. As generalizações que são feitas ficam então prejudicadas (NAMUR et
alii, 2009).
Admitiu-se que o mais simples então, seria o uso moléculas mais simples
como os sais da série de Hoffmeister (NAMUR et alii, 2009), de longo uso na
literatura. Vale ressaltar, que uma discussão profunda do efeito destes sais em
nível molecular ainda é um campo em aberto, fugindo do escopo desta
dissertação, uma vez que existem várias teorias (ZHANG e CREMER, 2006; DÉR et
alii, 2007; BOSTRÖM, WILLIAMS e NINHAM, 2003). Geralmente sabe-se que certos
sais, chamados de caotrópicos, desestabilizam muitas proteínas quando
adicionados às suas soluções e contrariamente, os cosmotrópicos as estabilizam
(DÉR et alii, 2007). De um modo geral o efeito dos sais da série de Hoffmeister é
mais acentuado pelos anions do que pelos cátions (ZHANG e CREMER, 2006).
Ao contrário de outras investigações onde o caotrópico SCN- protegeu o
Dtxd de precipitação (95 % de recuperação) na agitação em presença de CH2Cl2
(NAMUR et alii, 2009) aqui, nesta dissertação, houve diminuição da solubilidade
em 73 % na presença de CH3CO2C2H5. Ambos são solventes orgânicos e a proteína
é a mesma! Resumindo, a solubilidade de Dtxd passou de 95 % quando sonicado
na presença de CH2Cl2 para 27 % na presença de CH3CO2C2H5, ambos contendo
SCN-. Além disto, houve muitas diferenças nas frações solúveis do Dtxd sonicado
na presença de CH2Cl2 ou na presença de CH3CO2C2H5. Sabe-se, pela literatura
(THOMAS, BOZEMAN e LEARN, 1991) que o SCN- pode ser oxidado por peroxidase
situação gerada pela sonicação houve formação de radicais .OH, que podem ter
reagido com o SCN-, formando o ácido hipotiocianoso.
Assim,
SCN- + .OH HOSCN (1)
O HOSCN é um agente oxidante fraco que reage com grupos sulfidrila,
como, por exemplo, no Dtxd. Numa forma simplista, o Dtxd poderia ser
representado como FA-S-S-FB (NAMUR e BUENO DA COSTA, 2004), poderia ter
sido convertido em derivados tiocianato-sulfenila ou disulfetos (RSSCN ou RSSR)
como foi descrito para outras moléculas (THOMAS, BOZEMAN e LEARN, 1991).
Assim, propõe-se que a reação seja a seguinte:
2 HOSCN + FA-S- S-FB FA-S-SCN + FB-S-SCN + 2 .OH (2)
Por esta razão é que a diminuição de monômeros de Dtxd teria ocorrido in
tandem com o aumento de FA e FB (Figura 4).
O interessante foi que todos os outros íons estudados, exceto o PO42-
independentemente de serem caotrópicos (SCN- e Mg2+) ou cosmotrópicos (Cl-)
diminuíram a solubilidade de Dtxd durante a sonicação. Portanto o íon escolhido
para a formulação de Dtxd em REVs foi o PO42-. O mecanismo de ação deste íon,
como de outros, ainda é um fenômeno em aberto. As variações da água de
hidratação pela adição de sais não explica o efeito específico dos íons (ZHANG e
CREMER, 2006; BIRESAW, McKENZIE e BUNTON, 1985). O Dtxd estava em água e
os íons foram adicionados após. Neste pH 6,5 a carga líquida de Dtxd era
Portanto é razoável supor que uma interação iônica entre o Dtxd- carregado
negativamente- com o Mg2+ desfavoreceria a solubilidade, ou seja, precipitaria a
proteína após o contacto com a interface orgânica, maximizada pela sonicação a
40 W que aumentou enormemente a área de contacto. Portanto, aqui, o
fenômeno de Hoffmeister precisa ser entendido em termos de interações entre
íons e as macromoléculas (NAMUR, et alii, 2009; ZHANG e CREMER, 2006). O íon
escolhido para ser usado na formulação foi o PO42- por ter protegido a
conformação ―nativa‖ (inicial) do Dtxd: sem desenovelamento, sem exposição de resíduos hidrofóbicos e imunologicamente reconhecida. O Dtxd encapsulado em
REVs-Chi-PVA nestas condições foi liberado controladamente e com a
conformação imunologicamente reconhecida (Figura 29). Esta formulação de
REVs, a REVs-Chi-PVA/Dtxd, foi estabilizada graças às presenças de Chi e PVA.
A maior vantagem do uso de Chi no desenvolvimento de partículas para
veículos de uso oral é a sua alta propriedade de mucoadesão devido, segundo a
literatura, às interações iônicas entre os grupos aminos primários carregados
positivamente deste polímero e os grupos dos ácidos siálico e sulfônico,
carregados negativamente presentes no muco (CHAYED e WINNIK, 2007; ILLUM,
JABBAL-GILL e HINCHCLIFFE, 2001; HASSAN e GALLO, 1990). Nesta dissertação, a
Chi aumentou em 35 % a adesibilidade das vesículas REVs-Chi em relação às REVs
(Figura 20), o que é corroborado por outros dados da literatura (CHAYED e
WINNIK, 2007; ILLUM, JABBAL-GILL e HINCHCLIFFE, 2001; TAKEUCHI et alii,
1996; HASSAN e GALLO, 1990). Este aumento de 35 % na adesibilidade de REVs-
Chi à mucina, obtido nesta dissertação, poderia ser ainda melhorado.
Sabe-se que a propriedade de mucoadesibilidade da Chi pode ser
THURESSON e ARNEBRANT, 2008) ou grupo tiol (BERNKOP-SCHNÜRCH et alii,
2006), dentre outros. Estes grupos tióis na Chi formam ligações S-S com regiões
ricas em resíduos de cisteínas no muco (BERNKOP-SCHNÜRCH, et alii, 2006;
ROLDO et alii, 2004; LEITNER et alii, 2004), o que explicaria a sua maior
adesibilidade. Entretanto, estas modificações químicas de Chi, implicam em
aumento de custo (reagente; pessoal) e, para uma ampla utilização em saúde
pública, não é desejável na formulação em estudo (MARTINO, SITTINGER e
RISBUD, 2005; HUANG et alii, 2005a; KHOR e LIM, 2003; MADIHALLY e MATTEW,
1999). Mas, restava uma questão em aberto: a agregação das partículas de
REVs-Chi entre si. O PVA foi usado, como em outras preparações da literatura
como um ―surfactante‖ não iônico para evitar que as partículas se colabassem e se agregassem (BUENO DA COSTA, 2000).
Além do efeito estabilizador do PVA, o mais interessante a ser notado
nesta dissertação foi a imensa afinidade de PVA pela Mu- III (Figura 19). Houve
uma diferença de 2000 vezes da sua afinidade pela mucina quando comparado
com a afinidade da Chi pela Mu-III. Este fato foi explorado aqui, adicionando-o à
formulação de REVs-Chi, transformando-a em REVs-Chi-PVA. Sabe-se que a
afinidade grande pela Mu-III seria esperada pela Chi particulada (CUI, QIAN e
YIN, 2006; TAKEUCHI, YAMAMOTO e KAWASHIMA, 2001), mas não pelo PVA (HE,
DAVIS e ILLUM, 1998), apesar de ter sido observado aqui (Figuras 19 e 20).
Foram observadas diferentes proporções de adesão entre PVA-mucina, indo de
0,5 % (HE, DAVIS e ILLUM, 1998) até 22 % (TAKEUCHI et alii, 1996). Aqui, os
sistemas de estudo foram mais complexos: a Chi estava adsorvida às REVs de
SPC: Cho (6:1); o PVA estava adsorvido às REVs-Chi. Portanto, no sistema
à Mu- III do que em solução. Mesmo assim, as REVs-Chi-PVA se adsorveram 20 % a
mais à Mu-III do que as REVs-Chi (Figura 20). O mais interessante seria ver se
haveria correlação entre o comportamento destas partículas in vitro com suas
utilizações in vivo.
As interações entre partículas revestidas por Chi e mucina têm sido
explicadas como sendo de natureza iônica (CHAYED e WINNIK, 2007; TAKEUCHI
et alii, 2005; ILLUM, JABBAL-GILL e HINCHCLIFFE, 2001; HE, DAVIS e ILLUM,
1998; TAKEUCHI et alii, 1996; HASSAN e GALLO, 1990). Entretanto se se
consideram que os potenciais das partículas lipossomais observados nesta
dissertação (REVs; REVs-Chi; REVs-Chi-PVA foram - 9,40, -4,66 e -7,51) foram
todos negativos e que a mucina tem também carga negativa, deveria haver uma
repulsão entre as REVs e Mu e não atração como a que se observou (Figura 20).
Na melhor das hipóteses, a interação não deveria existir e isto contraria a
literatura (CHAYED e WINNIK, 2007; TAKEUCHI et alii, 2005; ILLUM, JABBAL-GILL
e HINCHCLIFFE, 2001; HE, DAVIS e ILLUM, 1998; TAKEUCHI et alii, 1996; HASSAN
e GALLO, 1990).
A melhor hipótese que se aceita é que a natureza da interação entre PVA
e Mu seja através de pontes de hidrogênio, como o que se observou nesta
dissertação. Portanto, a capacidade de formar pontes de hidrogênio com a
mucina é um requerimento sem o qual não há adesão entre os polímeros
(THOMAS e PEPPAS, 2008; PEPPAS et alii, 2000; BANSIL, STANLEY e LAMONT,
1995; STROUS e DEKKER, 1992). Têm sido muito estudadas as interações através
de pontes de hidrogênio entre polímeros mucoadesivos como o policianoacrilato
(PAA) e o muco (BURES e PEPPAS, 1999; SMART, KELLAWAY e WORTHINGTON,
existência das pontes de hidrogênio é razoável quando se pensa na estrutura da
mucina com os seus grupos carboxila das cadeias ramificadas dos açucares, o
ácido carboxílico e sulfato nos segmentos terminais das ramificações dos
carboidratos. Foram estas pontes de hidrogênio que aumentaram tanto a
afinidade de PVA por Mu (Figura 19). Entretanto, ressalta-se que só a presença
de PVA não é condição necessária para que haja interação entre partículas
recobertas e células, por exemplo, (NAKANO, TOZUKA e TAKEUCHI, 2008).
Foi muito interessante observar como a presença de Chi e/ou PVA nos
REVs mudou completamente o seu tamanho e a estrutura da bicamada lipídica.
As partículas lipossomais revestidas por Chi foram maiores do que as REVs
contendo somente SPC: Cho (6: 1) (Figura 43). Sabe-se, da literatura (VOROB’EV
et alii, 2007) que a presença de um soluto na água induz às modificações na
estrutura da água e da camada de hidratação desta molécula. Em condições
fisiológicas a Chi é capaz de captar 160 % mais de água (SILVA et alii, 2004) o
que pode ser muito explorado em engenharia biomédica de tecidos (MANO,
2008). Aqui, a Chi aumentou não só o grau de hidratação e, conseqüentemente,
o tamanho (167 nm 313 nm) e a morfologia dos REVs (Figura 43), como
também aumentou o tempo de residência do Dtxd no compartimento aquoso
interno do lipossoma (Figura 31). Por causa do aumento do tamanho de
lipossomas (127,1 nm 161,2 nm) após a adição de PVA-R (com âncora
hidrofóbica) admite-se que exista a associação deste polímero com a bicamada
lipídica (NAKANO, TOZUKA e TAKEUCHI, 2008) o que corrobora os resultados
obtidos nesta dissertação. Aqui, visivelmente (Figura 43) o PVA, também
quase elástico de luz) e modificou a morfologia da bicamada, que ficou mais
densa (Figura 43).
Alguns géis, chamados de materiais ou polímeros inteligentes (ou géis
sensíveis ao meio) são sensíveis ao meio: temperatura, campo magnético,
composição do solvente, pH ou luz (JUODKAZIS et alii, 2000; SEIDA e NAKANO,
1994) mudando de estado ou de volume, por exemplo. Destacam-se dentre eles
o NIPA (polivinil-acrilamida), PVME (poli vinil metil éter) e PVA (YAMAMOTO et
alii, 2003). O PVA expande ou se contrai (35 %), reversivelmente, de acordo com
a temperatura, o que é explicado em termos de hidratação- desidratação. O PVA
capta água através de pontes de hidrogênio em temperatura ambiente. A partir
de 37°C, o PVA descarta água (YAMAMOTO et alii, 2003). Aqui, não se observou
este fenômeno (mudança de tamanho com a temperatura) porque fugia do
escopo desta dissertação, mas, observou-se uma mudança na morfologia e na
densidade da bicamada lipídica, o que pode estar associado com os graus de
hidratações diferentes entre fosfolipídeo-Chi (REVs-Chi) e fosfolipídeo-Chi
associada à PVA (REVs-Chi-PVA) (Figura 43) mudando os seus raios
hidrodinâmicos (Tabela 2). No caso do PVA aparentemente houve exclusão de
água da camada de hidratação (Figura 43). Ambos, Chi e PVA controlaram a
velocidade de saída do soluto encapsulado (Dtxd) (Figuras 29- 31), como o
descrito na literatura (JAIN, SHARMA e VYAS, 2006) diminuindo-a em relação à
REVs. O mais interessante destes dados foi observar as correlações entre as
capacidades de adsorções diferentes nas partículas estudadas e as suas
características diferentes de induzir as formações de anticorpos contra Dtxd nos
100 nm 200 nm 200 nm
REVs REVs-Chi REVs-Chi-PVA
A B C
Figura 43. Efeitos de Chi e PVA no raio hidratação e na estrutura da bicamada de REVs
(SPC: Cho, 6:1).
Existem muitas evidências experimentais demonstrando que a
nanoencapsulação modifica a captura, o tráfico e o processamento do antígeno
além do efeito adjuvante mediado pelo próprio veículo ou ainda através de outra
molécula adicionada aos lipossomas, polímeros ou outros sistemas particulados
(BRAMWELL e PERRIE, 2006). Como se discutiu anteriormente, aqui o foco foi
o desenvolvimento de um veículo para vacina oral para a produção de anticorpos
de mucosa, a saber, os IgAs.
O que se observa é que quando antígenos são veiculados em sistema
particulados de liberação controlada contendo Chi há sempre um aumento na
resposta imunológica, quanto à produção de IgAs (AHIRE et alii, 2007; AMIDI et
alii, 2007; JAIN, SHARMA e VYAS, 2006; VAN DER LUBBEN et alii, 2003 e VAN DER
LUBBEN et alii, 2001). O que deve ser ressaltado aqui é a correlação entre a
complexidade de cada partícula obtida (REVs, REVs-Chi ou REVs-Chi-PVA),
contendo Dtxd, e a produção de IgAs.
Houve uma correlação direta entre produção de IgA salivar tanto
(R = 0,99718) e a interação de Mu com REVs ou as partículas revestidas quer
seja com Chi ou com Chi-PVA. Houve uma correlação direta entre produção
de IgA vaginal tanto animais injetados através da via oral (R = 0,99718)
quanto da via subcutânea (R = 0,98624) e a interação de Mu com REVs ou as
partículas revestidas quer seja com Chi ou com Chi-PVA. Não houve resposta
secundária quando o toxóide foi administrado livre aos animais. Houve uma
correlação direta entre a complexidade da formulação e resposta secundária
quanto à produção de IgA ou seja, REVs < REVs-Chi < REVs-Chi-PVA, tanto
após 7 dias quanto após 26 dias da administração da dose de reforço. Estes
dados, e este tipo de análise são os únicos na literatura. Infelizmente o que
se analisa é a simples produção de IgA, sem contudo correlacioná-la com as
propriedades das partículas (AHIRE et alii, 2007; AMIDI et alii, 2007; JAIN,
SHARMA e VYAS, 2006; VAN DER LUBBEN et alii, 2003). Mesmo quando a
intenção foi a de se produzir uma vacina oral e mesmo com imunização por
nebulização, o que se analisa é a produção de IgG, que é não é um anticorpo
produzido predominantemente em mucosa (ALPAR et alii, 2001; MIRSCHAMSY
et alii, 1996)!
Houve produção de IgG1 em todos os animais imunizados tanto através
da oral quanto naqueles imunizados via subcutânea as formulações
lipossomais usadas e também com Dtxd foi administrado na forma livre.
Entretanto poucos (AMIDI et alii, 2007) descrevem a produção de subtipos de
IgG na literatura (HAGENAARS et alii, 2009; AHIRE et alii, 2007; VAN DER
LUBBEN et alii, 2003). Foram observadas produções de IgG1 anti Dtxd desde os
primeiros dias após a imunização, mas as respostas foram maiores nas