Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) tem sido considerada como um dos principais patógenos emergentes de origem alimentar, e em vários países, infecções por estes microorganismos passaram a ser doenças de notificação compulsória.
O sorotipo O157:H7, identificado em todo o mundo desde o início da década de 80, tornou-se um importante problema de saúde pública pelas suas características de virulência que estão associadas à gravidade da doença e pela sua capacidade em causar surtos de extensas proporções.
Em determinadas áreas geográficas, infecções por outros sorotipos de STEC, conhecidos como STEC não-O157 podem ser mais freqüentes do que aquelas causadas por O157:H7. Infecções esporádicas e surtos de menores proporções estão mais freqüentemente associados a STEC não-O157, embora estes patógenos possam desencadear quadros clínicos semelhantes àqueles causados por cepas O157:H7, tais como CH e SHU (GERBER et al., 2002; BANATVALA et al., 2001; ELLIOT et al., 2001; TOZZI et al., 2003; BEUTIN et al., 2004; BLANCO et al., 2004a).
No Brasil, até a realização deste estudo, a ocorrência de casos esporádicos de diarréia infantil por STEC não-O157 foram relatados por alguns autores (GIRALDI et al., 1990; CANTARELLI et al., 2000; GUTH et al., 2002). Em 2002, casos de infecções esporádicas por STEC O157:H7 e de SHU por STEC O26:H11 foram relatados por IRINO et al. e GUTH et al., respectivamente. No entanto, através do presente estudo foi possível mostrar a presença de cepas STEC em nosso meio desde a década de 70.
Examinando uma coleção de cepas de E. coli isoladas no período entre 1976-99, foram identificadas cepas STEC entre aquelas pertencentes aos sorogrupos O26, O55, O111 e O157, como tem sido observado por outros autores
como sendo os sorogrupos STEC frequentemente associados às infecções no homem.
Interessante observar o encontro, entre a coleção de cepas de E.coli classificadas como não enteropatogências à época do isolamento, de uma cepa STEC do sorotipo O93:H19 isolada de uma criança com diarréia e uma cepa do sorotipo O118:H16 de um paciente adulto HIV+ apresentando diarréia.
Estes resultados mostram a importância da caracterização dos fatores de virulência na classificação destes enteropatógenos, pois cepas destes sorogrupos estão incluídas em diferentes categorias diarreiogênicas, e reforçam também a necessidade da implantação de métodos de detecção de STEC não-O157.
A freqüência de isolamento dos sorotipos de STEC não-O157 é variável nos diferentes países, possivelmente associada aos métodos de diagnóstico. Diferindo do O157:H7 que pode ser facilmente diferenciado no Agar MacConkey Sorbitol, as STEC não-O157 são dificilmente reconhecidas pela ausência de características fenotípicas que possam ser utilizadas na sua diferenciação. Por conseqüência, ainda são poucos os laboratórios que pesquisam este patógeno.
De acordo com estes resultados, infecções por STEC não-O157 parecem ser também mais freqüentes em nosso meio do que aquelas causadas pela O157:H7, à semelhança do que tem sido relatado em outros países (PRADEL et al, 2000; TOZZI et al, 2003; BLANCO et al., 2004a; BEUTIN et al., 2004).
Este dado pode ser confirmado durante o período do estudo prospectivo onde uma única amostra de STEC O157:H7 foi isolada de um paciente HIV+, enquanto as outras pertenciam a diferentes sorotipos (trabalho 4.1.2). Importante ressaltar também, que o primeiro caso de infecção humana por O157:H7, ocorreu em 1990 em um paciente HIV+ apresentando diarréia (trabalho 4.1.1 e 4.1.4).
Foi interessante observar também uma variação dos sorotipos STEC não- O157 encontrados em São Paulo no período 1976-03. Comparando os dados obtidos no estudo retrospectivo com aqueles mais recentes, foi possível verificar que enquanto o sorotipo O111:H8(H-) foi o mais freqüente até 1993, atualmente
este sorotipo é raramente encontrado entre as cepas STEC (trabalho 4.1.1 e 4.1.2).
Em 2003, TOZZI et al., também observaram que no período 1990-93, casos de SHU por STEC O111 eram freqüentes e passaram a ser raros na Itália a partir de 1993, mostrando que a incidência dos sorotipos não-O157 pode variar no decorrer do tempo.
Estudos realizados no Brasil, sobre a frequência de STEC nos animais, têm mostrado a presença de diferentes sorotipos de STEC portadores de fatores de virulência usualmente associados com o desenvolvimento de infecções graves no homem (CERQUEIRA et al., 1999; LEOMIL et al., 2003; VETORATO et al., 2003; IRINO et al., 2005). No entanto, quando se compara os sorotipos STEC não-O157 encontrados em nosso meio como causas de infecções no homem, pode-se verificar que estes sorotipos são raramente isolados dos animais estudados até o momento.
BETTELHEIM (2003), aponta o verdadeiro paradoxo existente nas infecções por STEC, pois enquanto os sorotipos mais comuns nas infecções no homem são aqueles menos freqüentemente isolados no animal sadio, os sorotipos mais freqüentemente encontrados nos animais são os mais raramente associados às infecções no homem.
Os sorotipos STEC descritos na literatura mundial, isolados de infecções humanas, de animais, do meio ambiente e de alimentos constam da lista de STEC, atualizada por BETHELHEIM (http://www.microbionet.com.au/vtectable.htlm).. Dentre estes, mais de 400 distintos sorotipos já foram identificados como associados a diferentes infecções do homem (http://www.lugo.usc/ecoli).
Embora os sorotipos de STEC não-O157, como causas de infecções humanas, sejam variáveis dependendo dos países, aqueles mais freqüentemente isolados e considerados como os principais sorotipos são representados por O111:H8(H-) e O26:H11(H-), pela gravidade da doença e número de surtos causados por estes sorotipos.
Entre os diferentes sorotipos STEC não-O157 identificados em nosso estudo, pode-se destacar que mais de 50% das cepas foram identificadas como O111:H8(H-) e O26:H11(H-), o que mostra a importância destes sorotipos STEC não-O157 no nosso meio, em particular o O111:H8(H-), embora atualmente este sorotipo seja raramente isolado.
Além disso, outros sorotipos tais como O77:H18, O93:H19, O103:H2, O118:H16, também foram observados no nosso meio como causas de infecções humanas, como tem sido descrito em outros países. Relatos sobre a ocorrência de infecções por cepas de STEC pertencentes a diferentes sorotipos têm sido cada vez mais freqüentes, destacando-se entre os mais comuns os sorotipos O91:H21, O103:H2, O113:H21, O118:H16 e O145:H-, além do O26:H11(H-) e O111:H8(H-) (MARIANI-KURKDJIAN et al.,1993; PATON et al.,1999 ; BEUTIN et al., 2004; SONNTAG et al., 2004).
Vários estudos têm demonstrado que cepas de STEC, de origem humana e não humana, apresentam uma grande variação em relação aos sorotipos e suas características de virulência. A existência de uma correlação entre determinados fatores de virulência e a gravidade da doença também tem sido observada (BOERLIN et al., 1999 ; BEUTIN et al., 2004; ETHELBERG et al., 2004)
Nas infecções por STEC, tanto os fatores inerentes ao hospedeiro como as características de virulência do patógeno estão associados com o desenvolvimento das formas graves da doença.
Em relação ao hospedeiro, a idade do paciente constitui um dos principais fatores de risco. Quanto às características de virulência da bactéria, a toxina Stx tem um papel central na patogênese das infecções causadas por STEC.
Dados epidemiológicos têm mostrado uma correlação entre o tipo de toxina Stx e a gravidade da doença. Alguns autores relataram que cepas de STEC que expressavam somente a toxina Stx2, estavam mais freqüentemente associadas a casos mais graves da infecção, enquanto cepas de STEC produtoras de Stx1 eram mais freqüentes em casos de diarréia sem complicações extra-intestinais (BOERLIN et al., 1999; ETHELBERG et al., 2004).
FRIEDERICH et al., (2002b) descreveram que as cepas STEC com o genótipo stx2 e stx2stx2c estavam associadas com maior freqüência com o desenvolvimento de SHU. Estes autores verificaram ainda que cepas portadoras dos genótipos stx1stx2 ou stx1stx2c eram menos freqüentes em pacientes com SHU e aquelas com os alelos stx2d e stx2e eram encontradas em pacientes que apresentavam somente diarréia ou em indivíduos assintomáticos.
Contrariando estas observações, RIOS et al. (1999), mostraram que no Chile, as cepas de STEC isoladas de pacientes com diarréia aguda e naqueles que evoluíram para a SHU, apresentavam os genótipos stx1stx2 , enquanto a seqüência stx2era encontrada em algumas cepas de O157:H7 de diferentes origens.
SCHMIDT et al. (1999), também haviam relatado que cepas STEC de diferentes sorotipos com o genótipo stx1 predominavam tanto em casos de diarréia como em casos de diarréia sanguinolena e SHU.
Os resultados obtidos no presente estudo são semelhantes aos descritos por SCHMIDT et al. (1999). O genótipo stx1 foi predominante entre as cepas STEC não-O157, sendo identificado também na cepa STEC do sorotipo O26:H11, isolada do paciente que desenvolveu a SHU (trabalho 4.1.5), e na cepa do sorotipo O103:H2, isolada de uma criança com anemia hemolítica (trabalho 4.1.7), que foram as formas mais graves de doença observadas no período estudado.
Na presente amostragem, a seqüência stx2 associada ou não a stx2c foi identificada apenas nas cepas STEC O157:H7. Foi interessante observar que as cepas de origem humana apresentaram o genótipo stx2stx2c, enquanto aquelas isoladas de bovinos e água carreavam apenas uma destas seqüências.
O gene eae é comumente encontrado em STEC isoladas de infecções humanas e com menor freqüência em cepas isoladas de animais.
BEUTIN et al. (2004), mostraram que entre cepas STEC não-O157 isoladas de pacientes de diferentes faixas etárias, as cepas eae+prevaleceram em crianças menores de 6 anos, principalmente de crianças entre 1 e 3 anos de idade, enquanto que cepas eae- eram mais frequentes em adultos.
Alguns autores têm também observado que entre os fatores de virulência de cepas STEC, o gene eae está relacionado com o desenvolvimento de formas mais graves da doença (BEUTIN et al., 1998; ETHELBERG et al., 2004), enquanto aquelas desprovidas desta seqüência têm sido mais freqüentemente encontradas em indivíduos assintomáticos (STEPHAN e UNTERMANN,1999).
Dentre as cepas STEC identificadas no presente estudo, a grande maioria era eae+ e apenas três delas, correspondentes aos sorotipos O55:H19, O77:H18 e O93:H19, isoladas de crianças com diarréia, não apresentaram esta seqüência. Segundo PATON et al. (2001), embora a intimina seja um fator de virulência importante, ela não é essencial à patogênese das STEC. Na ausência da intimina, outras adesinas, como por exemplo a adesina Saa, poderiam estar presentes nessas cepas, propiciando a aderência e a colonização do intestino.
Comparando os resultados referentes ao encontro de cepas eae- do presente estudo com os dados de outros países, pode-se verficar que pela existência de uma grande variabilidade de sorotipos STEC não-O157 em cada área geográfica, os sorotipos eae- aqui identificados foram em geral distintos daqueles encontrados por outros autores (KESKIMAKI et al.,1997, BONNET et al.,1998, PATON et al., 2001; JENKINS et al., 2003; FRIEDRICH et al., 2003).
O encontro do sorotipo O77:H18 (eae-) como causa de diarréia em uma criança em nosso meio, mostra que cepas STEC encontradas em animais, podem causar doenças no homem. Por outro lado, a detecção do sorotipo O93:H19 (eae-) em uma criança com diarréia, reforça o importante papel dos alimentos de origem animal como via de transmissão de STEC, pois este sorotipo está entre aqueles recentemente detectados em amostras de carne moída coletadas na região de Ribeirão Preto, SP (BERGAMINI et al., 2004;IRINO et al., 2005).
Tem sido descrito que determinados tipos de intimina estão associados com certos sorotipos e com a categoria diarreogênica de E. coli (ADU-BOBIE et al., 1989; OSWALD et al., 2000; BLANCO et al., 2004a; BEUTIN et al.,2004).
Os tipos de intimina que foram identificados neste estudo são aqueles mais freqüentemente encontrados em cepas de origem humana; coincidente com os
dados de outros países, foi observada uma associação entre os tipos de intimina e os sorogrupos das STEC. Assim, em todas as cepas pertencentes ao sorogrupo O111 foi identificada a intimina θ (Int-θ), enquanto a intimina γ (Int-γ) foi encontrada somente nas cepas O157:H7 e intimina β (Inti-β) ocorreu nas cepas do sorogrupo O26 e O118. Intimina ε (Int- ε) foi identificada nos sorotipos O103:H2 e ONT:H2, enquanto na cepa ONT:H8, foi identificada a Int-θ.
Possivelmente as cepas ONT:H2 e ONT:H8 originalmente pertenciam, respectivamente, aos sorogrupos O103 e O111, podendo ter ocorrido, no decorrer do tempo, uma perda parcial das cadeias laterais do polissacarídeo responsáveis pela especificidade antigênica , tornando-as não tipaveis (ONT).
Atualmente os tipos de intimina α, β e γ são classificados em subtipos α1 e α2, β1 e β2 , e γ1 e γ2, e de acordo com esta nova classificação, o subtipo γ2 corresponderia ao tipo de intimina θ (Int-θ) (ZHANG et al., 2002b). Neste estudo, cepas do sorogrupo O111 que previamente haviam sido classificadas como portadoras de intimina γ, pertenciam ao sub-tipo γ2 (Int-θ), confirmando a estreita associação desse tipo de intimina e o sorogrupo O111.
Entre os diversos fatores adicionais de virulência encontrados em cepas STEC, a enterohemolisina tem sido muito estudada. Pela sua alta correlação com a produção de Stx, a pesquisa de enterohemolisina foi sugerida por alguns autores como um teste de triagem das STEC .
No entanto, tem sido relatado que a produção de enterohemolisina não ocorre em todas as cepas STEC e determinadas amostras de E. coli não produtoras de Stx são capazes de produzi-la (STROCKBINE et al., 1998).
No presente estudo, verificamos que entre as 48 cepas de STEC, apenas 58,3% apresentaram a seqüência ehx e todas as cepas STEC e não STEC do sorogrupo O26 foram enterohemolíticas. Estes dados confirmam que esta característica pode estar presente em cepas não produtoras da toxina Shiga e a pesquisa da enterohemolisiana dificilmente poderá ser utilizado no diagnóstico de infecções por STEC.
Um menor percentual de cepas enterohemolíticas foi encontrado entre as cepas STEC do sorogrupo O111. Possivelmente esta característica esteja associada à origem das cepas aqui estudadas. Segundo SCHMIDT e KARCH, (1996) cepas enterohemolíticas do sorogrupo O111 são mais comuns entre aquelas isoladas de pacientes que desenvolvem SHU do que naquelas associadas à diarréia.
Considerando que as cepas STEC deste estudo eram originárias, na sua maioria, de casos esporádicos de diarréia, o encontro de apenas 25% de cepas enterohemoliticas no sorogrupo O111, parece estar justificado. Apesar desta freqüência relativamente baixa, a pesquisa deste fator de vïrulência em STEC isoladas de pacientes com diarréia deve ser realizada, pois poderá auxiliar na monitorização do paciente, uma vez que, segundo SCHMIDT e KARCH, (1996), a presença de enterohemolisina nas cepas STEC constitui um dos fatores de risco para o desenvolvimento de complicações extra-intestinais.
A grande diversidade genética das cepas STEC O157:H7 e STEC não
-O157, isoladas de infecções esporádicas, tem sido relatada por diversos autores quando técnicas como PFGE ou a associação desta com outros métodos têm sido utilizadas na sua subtipgem (PRESTON et al., 2000; WIELER et al., 2000; ZHANG et al., 2000; EKLUND et al., 2001; AVERY et al., 2002; GIAMMANCO et al., 2002; SONNTAG et al., 2004).
Em todo o mundo, a técnica do PFGE, pelo seu alto poder discriminatório, tem sido um método extensivamente aplicado na elucidação de surtos de infecções por STEC O157 e não-O157 (BARRETT et al., 1994; PATON et al., 1996; ISUMIYA et al., 1997; BREUER et., 2001; WERBER et al., 2002; BOPP et al., 2003; COMBS et al., 2003). No entanto, a utilização de distintos protocolos na caracterização de STEC não-O157, tem muitas vezes, dificultado a comparação de resultados obtidos nos diferentes países.
A aplicação da técnica da PFGE na análise comparativa de cepas STEC de diferentes origens, tem comprovado que bovinos constituem os principais reservatórios destes microorganismos, mostrando ainda a presença, nestes animais, de diferentes linhagens clonais, algumas delas mais virulentas para o
homem (OSEK, 2001; PRADEL et al., 2001; CHINEN et al., 2003; MORA et., 2004 , LEOMIL et al., 2005).
Pela análise do padrão de macro-restrição das cepas incluídas em nosso estudo, uma extensa heterogeneidade genética nas cepas pertencentes a cada sorogrupo foi identificada. Comparando as cepas STEC e não STEC de um determinado sorogrupo, pode ser observado que, apesar desta grande diversidade genética, cepas STEC e não STEC constituem grupos clonais distintos, exceto no sorogrupo O26.
Analisando os padrões de restrição das cepas do sorogrupo O26, embora distintos perfis de PFGE tenham sido observados, cepas STEC e não STEC compartilharam os mesmos grupos clonais, evidenciando a existência de uma alta relação entre as cepas deste sorogrupo. EKLUND et al. (2001), estudando os padrões de macro-restrição, de diferentes sorogrupos STEC, relataram que cepas pertencentes ao sorotipo O26:H11 eram estreitamente relacionadas.
Com relação à atividade enterohemolítica e os tipos de intimina, no sorogrupo O26, foi possível verificar que cepas STEC e não STEC, foram enterohemoliticas e apresentaram o mesmo tipo de intimina (Int-β) ao contrário dos outros sorogrupos onde estas características foram distintas nas cepas STEC e não-STEC. Além disso, cepas STEC e não STEC Ram- Dul- permaneceram no mesmo grupo (A), enquanto algumas cepas não-STEC Ram+Dul+ pertenciam a grupos menos relacionados ( B e C). Observações semelhantes foram relatadas por outros autores que mostraram que E.coli O26 Ram- Dul- podem ser STEC ou EPEC atípicas (LEOMIL et al., 2005).
Analisando o dendrograma obtido a partir do perfil de PFGE das cepas STEC e não STEC do sorogrupo O111, foi possível observar que as cepas desse sorogrupo foram classificadas em dois distintos grupos clonais. Um grupo é constituído pelas cepas stx+ e o outro pelas cepas stx-. No grupo formado pelas cepas STEC, a similaridade entre elas foi notadamente maior do que entre as cepas stx-.
No grupo das cepas STEC O111, foram observados vários subgrupos estreitamente relacionados, apresentando um índice de similaridade maior que
80% entre algumas cepas. Curiosamente, a cepa STEC O111:H-, isolada de bovino, estava mais relacionada às cepas stx-.
As cepas STEC pertencentes ao sorogrupo O111, também se diferenciaram das cepas não STEC pelo tipo de intimina e pelo teste da descarboxilação da lisina. Enquanto as cepas STEC apresentaram intima Int-θ e não descarboxilaram a lisina, as não STEC se diferenciaram por descarboxilarem a lisina e pela presença da intimina Int-α.
No sorogrupo O111, o teste da descarboxilação da lisina, de uso rotineiro nos laboratórios clínicos, poderá ser útil na identificação presuntiva de STEC O111, quando isoladas de crianças menores de 5 anos e identificadas sorologicamente como O111.
Interessante observar que duas cepas do sorogrupo O111 apresentaram um índice de similaridade de 90%. Analisando o perfil de restrição, estas duas cepas apresentaram o mesmo número de bandas com diferenças mínimas, que podem ter resultado de um rearranjo nos seus genomas. Uma dessas cepas correspondia ao sorotipo O111:H8 (stx- eae+), a única entre as cepas stx-, portadora de Int-θ; enquanto a outra pertencia ao sorotipo O111:H- (stx+ eae+) também Int-θ, ambas isoladas de um mesmo paciente.
Possivelmente a perda espontânea do gene stx pela cepa O111:H- poderia ter originado a variante stx- com poucas variações no seu perfil genético. Perdas espontâneas de stx têm sido observadas em cepas de STEC O157:H7 durante subculturas no laboratório (KARCH et al., 1992).
MELLMANN et al., em 2005, mostraram que a perda dos genes stx pode ocorrer no curso da doença. Acompanhando pacientes com SHU, estes autores verificaram que pacientes que excretavam cepas stx+ no início da doença passavam a eliminar cepas do mesmo sorotipo porém desprovidas de stx. Alertam os autores que o tempo de coleta dos materiais dos pacientes pode ser crítico na recuperação das cepas stx+. Nas coletas realizadas na fase tardia da doença, o agente recuperado poderá já estar desprovido da seqüência stx.
No sorogrupo O157, cepas STEC de origem humana e não humana apresentaram diferentes perfis de restrição. Além disso, na análise do dendrograma
também foi observado que as STEC O157:H7 formaram um grupo distinto daqueles que incluíam as cepas não STEC, à semelhança do que foi observado no sorogrupo O111.
Duas cepas STEC O157:H7, isoladas de pacientes da mesma área geográfica, em um intervalo de tempo de aproximadamente 15 dias, apresentaram padrões de macro-restrição idênticos. Investigação epidemiológica realizada à época do isolamento destas cepas não evidenciou qualquer ligação entre estes dois pacientes, embora o padrão idêntico de PFGE seja sugestivo de uma origem comum.
Observou-se também que no período estudado, distintos clones pertencentes aos sorotipos O118:H16 e O103:H2 foram responsáveis por infecções esporádicas em crianças e adultos.
Por outro lado, a análise molecular de cepas isoladas de bovinos revelou que diferentes animais de um mesmo ambiente podem estar colonizados pelas mesmas cepas, mostrando que a disseminação pode estar ocorrendo nestes ambientes, podendo assim contaminar o homem.
A caracterização molecular aponta para a ocorrência, no período estudado, de um provável surto por STEC O157:H7, posssivelmene o único conhecido até o momento no Brasil, enquanto cepas STEC não-O157, representando cada qual um clone distinto, foram causas de casos esporádicos de diarréia em crianças e adultos.
Os dados deste estudo mostram que STEC de diferentes sorotipos com características genéticas distintas estão presentes em nosso meio, podendo ser causas de surtos de proporções importantes. Estes resultados mostram ainda, que excetuando-se o sorogrupo O26, cepas STEC e não-STEC pertecentes aos sorogrupos estudados, possivelmente apresentam origens distintas.