Segundo Junqueira e Junqueira (1983), fixação é o procedimento que visa manter de modo definitivo as estruturas citológicas e histológicas dos vários tecidos, e que não existe fixador ideal, tendo todos eles vantagens e desvantagens. Devido a essas dificuldades é que, na tentativa de encontrar a fixação adequada ao material analisado, os pesquisadores tenham que testar alguns deles até obter um resultado satisfatório.
Um dos fixadores mais utilizados no cotidiano da histotécnica é o formol, provavelmente devido ao seu baixo preço e fácil preparo. Quando utilizado para a fixação em parasitos o formol diluído costuma ser aquecido para melhorar sua atuação, contudo, com o uso deste fixador não foi possível a realização satisfatória da coloração, talvez pela quase não penetração do formol nas estruturas do verme devido à espessa cutícula deste.
O AFA (Ácido Acético, Formol 40% e Álcool Etílico) mostrou-se um bom fixador, pois penetrou satisfatoriamente pela cutícula do verme, alcançando suas estruturas internas. É provável que a associação entre ácido, formol e álcool tenha potencializado a função de fixação do formol. Após a realização do procedimento com AFA, os vermes ficaram todos muito esticados, fato que auxiliou na inclusão.
O Paraformaldeído é um sal que deve ser diluído em água destilada para ser utilizado. O único inconveniente observado na utilização de Paraformaldeído é que todos os exemplares fixados ficaram enovelados, o que dificultou a realização dos processos restantes.
Dos métodos de coloração propostos (Carmim, Azul de Toluidina, Giemsa e HE) o que melhor evidenciou as estruturas a serem estudadas foi HE. O método HE é, certamente, um dos métodos mais difundidos na histopatologia devido a fatores como seu baixo valor de mercado, praticidade de sua confecção e utilização, e por proporcionar colorações, que além se serem muito bonitas, são também ricas em detalhes histológicos o que auxilia na observação dos cortes.
32 L. minor apresenta três lábios distintos, característica inerente a todos os ascarídeos, sendo dois destes subventrais e um subdorsal, sulco pós-labial, interlábios e papilas cefálicas (Sprent 1971a).
A presença de um sulco pós-labial é o diferencial marcante deste gênero, este separa a região dos lábios do resto do corpo e origina o interlábio. Características como disposição e aspecto do interlábio parecem relacionar-se com atividade sensitiva (Oliveira 1999).
Sua cutícula tem aspecto serrilhado, sendo dividida em duas regiões: a camada mais externa, chamada de camada cortical, e a camada interna. Suas principais funções são a proteção do organismo do helminto contra as ações externas e a de exoesqueleto, servindo de apoio para a ação dos músculos (Rey 1991). Observa-se que em L. minor não há estriações na região cefálica, contudo elas estão no restante do corpo e estão distanciadas entre si por aproximadamente 0, 003 mm (Sprent 1971a).
Ainda analisando a cutícula de L. minor, encontra-se uma estrutura denominada asa lateral. A asa lateral é uma saliência da cutícula que tem seu início na região do esôfago, próximo ao anel nervoso, tornando-se gradativamente estreita, quando na porção posterior do corpo do verme. Subjacente à asa lateral e interligada a esta, encontra-se a linha lateral. Esta estrutura percorre, longitudinalmente, todo o corpo do helminto e parece auxiliar na motilidade do parasito ou facilitar no processo de escavar os tecidos do hospedeiro (Sprent 1971a).
A linha lateral parece apresentar dois tipos celulares distintos: algumas de suas células são claras e outras são escuras. Nas células claras estão muitos vacúolos grandes; já nas células escuras, estão vacúolos pequenos. Quando analisada em microscopia de luz, sua morfologia muito se assemelha ao tecido adiposo de diversos animais mamíferos.
Imediatamente abaixo da cutícula e percorrendo toda a extensão do parasito, está a hipoderme ou subcutícula, que tem como função provável a sustentação e preenchimento (Oliveira 1999).
33 Observou-se neste trabalho as mesmas estruturas musculares encontradas por Oliveira (1999).O sistema muscular de L. minor inicia-se na região da hipoderme ou subcutícula. Apresenta células em forma de “U” com fibras radiais em relação ao corpo do verme (Oliveira 1999) muito semelhantes às observadas nos estudos de Rosenbluth (1965a) com A. lumbricoides. As células musculares do verme parecem ser contínuas, estendendo- se no sentido longitudinal por toda a extensão de seu corpo.
A região globosa é o sarcoplasma da célula muscular onde se localizam várias organelas e grânulos de glicogênio (Oliveira 1999).
O tubo digestivo de L. minor é formado por esôfago, intestino, reto e cloaca (Leiper 1909). O intestino do verme encontra-se todo revestido por um tipo de capa denominada cápsula cuticular e parece ser formado por dois tipos celulares, as células claras e as escuras. A possível explicação para esta diferença na cor poderia se relacionar com a quantidade de organelas presentes nas células intestinais e com a composição química destas células (Oliveira 1999), onde as chamadas células claras teriam pouca quantidade de organelas e as células escuras teriam muita quantidade destas.
Na porção apical das células intestinais existe uma delgada camada delimitadora que, nitidamente, separa o corpo celular da borda em escova e da luz intestinal. Não se conhece a natureza estrutural desta camada. Já a borda em escova, por sua vez, muito provavelmente estejam ligadas à função de absorção dos nutrientes.
O aparelho reprodutor do verme adulto macho de L. minor é composto por alça testicular, vesícula seminal, vaso deferente, ducto ejaculatório e como órgão acessório à cópula, apresenta os espículos.
Em relação à alça testicular nota-se que quanto mais próxima da porção anterior do corpo do helminto ela está, mais as espermatogônias de seu interior variavam em sua forma. Quando a alça testicular está localizada na região anterior do verme, suas espermatogônias apresentam pouco citoplasma e um grande núcleo, que ocupava quase toda a célula. À medida que as espermatogônias se aproximam da vesícula seminal sua
34 forma novamente se altera, passando a apresentarem forma achatada, um grande espaço intercelular e grânulos..
A alça testicular apresenta grânulos de secreção e de glicogênio (Oliveira 1999) e está repleta de espermatogônias. Quando estas espermatogônias se aproximam da vesícula seminal, sua estrutura se modifica, havendo aumento de tamanho e variação nos grânulos do interior (Favard 1961 e Foor 1968) segundo trabalho de Oliveira (1999) estes grânulos se agrupam até que haja a formação de um grânulo único chamado de corpo refringente, provavelmente estas modificações estejam relacionadas com o processo de maturação dos espermatozóides.
A vesícula seminal é um componente do aparelho reprodutor que apresenta grandes células com citoplasma denso e repleto de grânulos que, provavelmente, secretam seu conteúdo no seu interior. É na vesícula seminal que os espermatozoides amadurecem, passando a apresentar pseudópode.
O ducto ejaculatório de L. minor apresenta células muito diferentes das encontradas nas alças testiculares e na vesícula seminal. Suas células epiteliais são cilíndricas, com ápice arredondado e com grandes espaços evidentes entre elas.
Os espículos são órgãos de natureza quitinosa acessórios à cópula comuns a quase todos os nematoda. Eles podem ser em número de um ou dois, protraídos ou retraídos e são introduzidos na vagina não funcionando como um pênis, e sim como dilatador do órgão feminino e guia para os espermatozoides (Pessoa & Martins 1974).
Em L. minor os espículos são observados em cortes transversais. Eles são estruturas levemente recurvadas, com extremidades afuniladas e com um nítido canal localizado em seu centro. É provável que este canal sirva como condutor ou armazenador de alguma substância importante para a cópula (Oliveira 1999).
35
8. CONCLUSÕES
Na caracterização histológica dos exemplares adultos machos de Lagochilascaris minor em cortes transversais e longitudinais, corados pela técnica de HE foram evidenciadas diversas estruturas, sendo que, muitas dentre estas são comuns a outros vermes da família Ascarididae, como é o caso da cutícula, hipoderme, sistema muscular e espermatozoides. Outras, por sua vez, são próprias do gênero Lagochilascaris, como o suco pós-labial e a asa lateral.
Poucos estudos foram realizados abrangendo os aspectos histológicos dos vermes adultos machos de L. minor. Esta carência de material de estudo e pesquisa prejudica muito no diagnóstico desta helmintose, visto que os cortes histopatológicos de materiais obtidos por biópsia das lesões de pacientes demonstram ser uma das principais maneiras de diagnóstico da lagochilascaríase humana.
A presente documentação, por meio de cortes histológicos, trouxe imagens inéditas da morfologia dos vermes adultos machos do parasito estudado. Com o auxílio destas, como material de apoio, pode-se aprimorar o diagnóstico da doença em animais e humanos, sendo sugestão do presente trabalho a organização de um banco de imagens ou publicação de maior acessibilidade para sua identificação em material não convencional à pesquisa, como carnes de animais silvestres.
Empregando-se os métodos de fixação Formalina a 10% a quente, AFA e Paraformaldeído a 4% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2, estabeleceu-se que apenas a Formalina a 10% a quente não conservou nem penetrou bem no material, talvez devido à espessa cutícula do helminto.
Já em se tratando da coloração, das quatro testadas inicialmente, Carmim, Giemsa, Azul de Toluidina e HE, a que se mostrou mais adequada para o procedimento em L. minor foi a HE, que, além de ser de fácil execução, evidenciou de forma nítida as estruturas externas e internas do verme.
36 Estas informações são úteis e fundamentam critérios para a escolha, dentre as técnicas de fixação e coloração testadas neste trabalho, que viabilizem o reconhecimento do parasito em cortes histológicos em material humano e animal.
Finalmente conclui-se que todo o material produzido contribui na geração de conhecimento, o que poderá acarretar melhorias na política interna de abate e inspeção das carnes de animais silvestres, pois evidencia imagens e informações novas, que poderão ser acionadas em exames durante o processo de seleção das carcaças na triagem destas carnes destinadas ao consumo humano.
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9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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44
10. ANEXOS 10.1. Anexo 1
10.1.1- Metodologia da técnica de preparação e concentração de ovos de L. minor (Oliveira, 2002):
Material biológico:
• Fezes de gatos infectados com Lagochilascaris minor.
Material utilizado: • bastão de vidro • cálice (grande) • gaze dobrada • peneira • formalina 1%
• tubos Falcon diversos
• sulfato de zinco com densidade de 1, 180 • densímetro
• estante para tubos
45 • trompa d’água
• luvas descartáveis Procedimento:
1. Colher todas as fezes do gato;
1.1. Macerar toda amostra com pequena quantidade de água em cálice graduado grande; 1.2. Após a maceração, preencher todo o cálice com água e homogeneizar;
1.3. Preparar de 15 a 20 cálices com peneira coberta com gaze (dobrada 2x) dependendo da quantidade das fezes;
1.4. Distribuir o material homogeneamente entre os cálices e ir completando o cálice com água, sobre a gaze, para a total lavagem do material e preenchimento total do cálice; 1.5. Após a lavagem do material, espremer a gaze na peneira com o auxílio de uma espátula;
1.6. Os cálices devem ser rigorosamente lavados por no mínimo 5x antes da concentração. O critério deve ser o quão límpido está o sobrenadante;
1.7. As lavagens ocorreram da seguinte maneira:
1° dia – deixar sedimentar por 24 horas;
2° dia – com a trompa d’água retirar somente a metade do líquido do cálice e completar
com água;
3° dia – ao chegar “balançar” os cálices para sedimentar o que se acumulou nas paredes do
mesmo, no mínimo 1 hora depois, retirar o sobrenadante até que o halo (formado pelo