Dispositivos de análise rápida, genossensores e diagnóstico do HCV

Atualmente observa-se um rápido desenvolvimento de dispositivos sensores utilizando DNA como material de biorreconhecimento para a detecção da hibridização. Estes dispositivos são considerados como ferramentas importantes devido a sua ampla aplicação, abrangendo desde testes clínicos descentralizados até o monitoramento ambiental, detecção de micro-organismos infecciosos e investigações forenses. Dentre os métodos de detecção existentes, os eletroquímicos têm se destacado devido à simplicidade do procedimento, rápida resposta, baixo custo relativo e compatibilidade com a tecnologia de microfabricação. Portanto, os genossensores eletroquímicos combinam a alta seletividade do evento de hibridização com a sensibilidade, e a realização de testes clínicos descentralizados (HEJAZI, 2010).

Existe, atualmente, uma intensa busca por dispositivos sensores capazes de identificar o vírus da Hepatite C em pacientes de maneira mais rápida, evitando, assim, maiores complicações para a saúde do paciente e também para que este não contamine outros por ignorar a doença da qual é portador. Os biossensores, atualmente em estudo, utilizam os mais diversos elementos de reconhecimento biológico imobilizado no dispositivo transdutor, assim como diferentes estratégias para a detecção do vírus. Na Tabela 1 são listados os trabalhos relatados na literatura envolvendo a detecção do HCV com a utilização de células, anticorpos e lectinas como elemento de biorreconhecimento.

Tabela 1: Biossensores relatados na literatura, que utilizam como material de reconhecimento biológico células, anticorpos e lectina para promover o diagnóstico do HCV.

Material de reconhecimento

biológico

Transdutor / detecção Amostra

clínica referência

Células do fígado

Células imobilizadas em tubo condutor / detecção

potenciométrica

S* KINTZIOS, 2001; KINTZIOS, 2001 Anticorpo Arranjo com Nanopartículas de

ouro / detecção potenciométrica N TANG, 2010 Anticorpo Detecção tipo Elisa /

fluorescência via HRP N WANG, 2005 Anticorpo

ITO modificado com fibra ótica / detecção de

quimioluminescência

S KONRY, 2005

Anticorpo GCE/AuNP / detecção

eletroquímica – DPV S MA, 2012 Anticorpo Detecção piezelétrica N TIMURDOGAN,

2011 Anticorpo

Detecção potenciométrica via atividade da enzima α-L-

fucosidase

S OTHMAN, 2011

Lectina Interação lectina – anticorpo

anti-HCV / detecção por SPR N LOZACH, 2003 *S – sim; N-não

A escolha do elemento de biorreconhecimento depende de alguns fatores, tais como, especificidade, sensibilidade, condições para estocagem e estabilidade operacional e ao ambiente. Sendo importante, também, nesta seleção a consideração da molécula alvo (WIRTH, 2010). Embora a utilização de células, anticorpos e lectinas como material de reconhecimento biológico possibilite a detecção do HCV e, consequentemente, o diagnóstico, a realização da genotipagem não é viabilizada.

Tendo em vista a realização do diagnóstico do HCV, sabe-se que para a escolha de um tratamento adequado, além da detecção do vírus, a identificação de seu genótipo é de fundamental importância. Embora os sensores construídos utilizando-se como material de biorreconhecimento células, anticorpos e lectinas realizem a detecção do HCV com alta eficiência, estes são incapazes de promover a genotipágem viral. Além disso, esses biossensores, assim como os testes sorológicos de diagnóstico, dependem da janela imunológica, no caso da utilização de anticorpos, e de uma quantidade de partículas virais detectáveis circulantes, para os sensores que utilizam células e lectinas. O emprego de material genético, RNA e DNA, como elemento de biorreconhecimento elimina o tempo de replicação viral e produção de anticorpos, viabilizando, desta forma, um diagnóstico precoce. Além disso, a identificação do material genético viral torna possível a genotipagem, levando, assim, à escolha do tratamento mais adequado a ser administrado em um tempo reduzido.

Os trabalhos relatados na literatura envolvendo o estudo de biossensores, que empregam material genético como elemento de biorreconhecimento, são mais numerosos que aqueles anteriormente citados, como apresentado na Tabela 2. Observa-se que, embora seja possível a utilização de RNA, o DNA é mais comumente utilizado. Esta última opção torna-se mais vantajosa quando se considera a estabilidade de ambas as biomoléculas, pois a molécula de RNA está muito mais propensa à degradação do que a molécula de DNA. Sendo assim, genossensores construídos utilizando DNA como elemento de biorreconhecimento terão uma vida útil mais longa, podendo permanecer por um período mais longo em estoque.

Nota-se também, pela observação da tabela apresentada que, existe uma maior prevalência de genossensores estudados para o diagnóstico de HCV utilizando os métodos eletroquímicos na transdução do sinal de biorreconhecimento. Os métodos eletroquímicos, além de possuírem um baixo custo relativo e serem de fácil manuseio, são muito promissores quando se trata de miniaturização do sistema de análise. Apesar das suas inúmeras vantagens, os dispositivos desenvolvidos para o diagnóstico molecular do HCV relatados na literatura têm também utilizado, para a detecção, métodos envolvendo compostos coloridos e fluorescentes (SHEN, 2011; WANG, 2009; SOCHOL, 2011).

Tabela 2: Biossensores relatados na literatura, que utilizam como material de reconhecimento biológico DNA, PNA e RNA para promover o diagnóstico do HCV

Material de reconhecimento

biológico

Transdutor / detecção PCR Amostra

clínica genotipagem Referência

RNA

Interação RNA – proteína viral / Utilização de quantum-dots /

detecção por emissão de fluorescência N* N N ROH, 2010a; ROH, 2010b; ROH, 2011; ROH, 2012 RNA Interação RNA – proteína viral

/ detecção por SPR S* N N LEE, 2007 DNA

Arranjo de microeletrodos / detecção com marcador

fluorescente

S S S BIDAN, 1999

DNA

GCE / detecção por eletrocatálise / utilização de sonda modificada com AuNP

S S N LI, 2012

DNA

Eletrodo de ouro / sonda modificada com tionina / detecção por meio DPV e SWV

utilizando BamH1

N N N LIU, 2009

DNA

GCE / sonda modificada com tionina e HRP em capsuladas em nanoesferas de ouro /

detecção por meio DPV utilizando BamH1

N N N TANG, 2011

DNA sonda de PNA

Eletrodo de ouro / detecção via

intercalante (azul de metileno) N N N AHOUR, 2012 DNA

Eletrodo de grafite de lapiseira / detecção via oxidação direta da

base nitrogenada guanina

N N N POURNAGHI-

AZAR, 2009

DNA

Utilização de quantum-dots / detecção por emissão de

fluorescência

N N N GIRAUD, 2010

DNA CD-trodo / detecção

eletroquímica via HRP S S N ULIANA, 2011 DNA

Separação de gel SDS / detecção colorimétrica via

atividade enzimática

S S N GLYNOU, 2003

DNA Microscopia de varredura

eletroquímica S S S

RICCARDI, 2008 DNA Eletrodo de ouro / detecção

piezelétrica S S S

SKLADAL, 2004 DNA Eletrodo de grafite / detecção

eletroquímica via HRP S S S

RICCARDI, 2006

DNA Detecção por SPR S S N O’MEARA,

1998 DNA

sonda de PNA

FET / utilização de nanotubos

de carbono N N N

DASTAGIR, 2007 DNA Eletrodo de platina / detecção

piezelétrica N N N BIDAN, 2000

DNA Superfície de ouro / detecção

por SPR N N S ZYBIN, 2005

DNA

Eletrodo de ouro / detecção de RNA viral por espectroscopia de impedância eletroquímica

N N N PARK, 2010

DNA sonda de PNA

Eletrodo de ouro / detecção eletroquímica (DPV) via intercalante (azul de metileno)

N N N

POURNAGHI- AZAR, 2010; HEJAZI, 2010

Muitos esforços têm sido empregados no sentido de se desenvolver genossensores capazes de detectar quantidades cada vez menores de material genético viral e que sejam, ao mesmo tempo, passíveis de miniaturização, para compor os dispositivos de análise rápida como compartimento de detecção. E um enorme progresso tem sido alcançado no desenvolvimento de genossensores eletroquímicos, porém existem ainda muitas dificuldades a serem superadas até que os biossensores de DNA se tornem portáteis e amplamente comercializados. O primeiro desafio relaciona-se ao fato de que os biossensores de DNA necessitam de um preparo, pois a amostra a ser analisada não está prontamente disponível. Sendo assim, muito trabalho precisa, ainda, ser feito para o desenvolvimento de métodos miniaturizados de preparo e amplificação da amostra (ODENTHAL, 2007).

OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho consistiu no desenvolvimento de um genossensor para a realização do diagnóstico da Hepatite C. E, conjuntamente, o estudo da viabilidade de utilização deste genossensor como componente de detecção de um futuro dispositivo para análise in situ.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Construção e caracterização de um eletrodo de carbono impresso com vistas à sua aplicação como transdutor do genossensor a ser desenvolvido.

2. Desenvolvimento do genossensor para realização da detecção do vírus da Hepatite C. Estudo de seletividade do sensor construído. Avaliação da viabilidade de realização do procedimento de genotipágem empregando o sensor estudado.

3. Estudo da viabilidade de miniaturização do genossensor desenvolvido e caracterização de seu funcionamento como célula de detecção de um futuro dispositivo para análise in situ.