4.3 METODOLOGIA
4.3.1 Obtenção das amostras
Após prévio esclarecimento e consentimento dos indivíduos incluídos nos grupos em estudo, foi coletada uma amostra de 10ml de sangue venoso sem anticoagulante, bem como 10ml de sangue venoso em tubo com EDTA. Em seguida, o material foi centrifugado por 10min. a 3.500rpm (Centrífuga Eppendorf 5416, Hamburg, Alemanha) e as amostras de soro foram subdivididas em 3 alíquotas, as quais foram armazenadas à temperatura de -80°C, até serem utilizadas nas determinações laboratoriais. A coleta de sangue foi realizada no Ambulatório de Reumatologia do Hospital Evangélico de Curitiba e as determinações laboratoriais foram realizadas integralmente no Laboratório de Imunopatologia do Hospital de Clínicas da UFPR.
As coletas do sangue de pacientes e familiares tiveram início, a partir da aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade Evangélica do Paraná e pela Direção do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (agosto de 2007), e foram encerradas em abril de 2009.
4.3.2 Pesquisa de auto-anticorpos
Todas as amostras de soros dos grupos em estudo foram investigadas para os anticorpos anti-CCP, por ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA), utilizando-se kits comerciais (Inova Diagnostics Inc., San Diego, CA, USA). A pesquisa do FR foi realizada por técnica de aglutinação em látex (BioSystems, S.A., Barcelona, Espanha). Por técnica de IFI, foram investigadas a presença dos auto- anticorpos anti-músculo liso (AML), anti-mitocôndria (AMA), anti-microssoma de fígado e rim (LKM), anti-célula gástrica parietal (CGP), anti-endomísio (EmA-IgA) e anti-nuclear (FAN). As amostras positivas para o FAN foram avaliadas para a presença do anticorpo anti-dsDNA, por IFI.
4.3.3 Pesquisa do anticorpo anti-peptídio cíclico citrulinado (anti-CCP)
Todas as amostras foram diluídas na proporção 1:101, em tampão de diluição (solução tampão salina Tris, Tween 20, estabilizadores protéicos e conservante). Os controles negativo, positivos alto e baixo não necessitavam de diluição prévia. Em seguida, aplicou-se 100µl de cada amostra e controles aos micropoços de poliestireno revestidos com antígeno purificado. Após incubação de 30min. em temperatura ambiente (20°C-26°C), fez-se 3 lavagens com tampão de lavagem específico (solução tampão salina Tris e Tween 20) para a remoção dos anticorpos que não se ligaram.
Após as lavagens, foi adicionado o anticorpo secundário conjugado (anticorpo anti-IgG ligado à peroxidase). Nesta etapa, o anticorpo secundário liga-se ao anticorpo primário, formando um complexo. A reação ocorre em 30min. à temperatura ambiente.
O excesso de anticorpo secundário que não se ligou foi removido por 3 lavagens com tampão de lavagem e, em seguida foram adicionados, a cada poço,100µl do cromógeno tetrametilbenzidina, fornecedor de hidrogênio para a reação do substrato peróxido de hidrogênio (H2O2) com a peroxidase. Após nova incubação por 30min. à temperatura ambiente e no escuro, adiciona-se a solução de parada (ácido sulfúrico 0.344mols/l) em cada escavação da placa (Figura 17)
A reação enzimática gera um produto colorido cuja intensidade de cor foi aferida em leitor de ELISA (Organon Teknika Reader 530 version 1,24), a 450nm (Figura 18).
FIGURA 17 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA REAÇÃO DE ELISA PARA O ANTI-CCP
FONTE: Adaptado de www.mbl.co.jp/diagnostic/measurement.html
FIGURA 18 - LEITOR DE ELISA E PLACA UTILIZADA NAS REAÇÕES
FONTE: O autor (2009)
O cálculo da concentração de anti-CCP foi realizado por comparação da cor desenvolvida nas amostras, em relação à cor obtida nos controles, conforme orientação do fornecedor. A reatividade para cada amostra foi calculada pela divisão
Controle Negativo Controle Baixo + Controle Alto +
da média da absorbância da amostra pela média da absorbância do controle baixo positivo. O resultado foi multiplicado pelo número de unidades encontradas no controle baixo positivo.
Título da amostra = absorbância amostra x valor do controle baixo positivo (unidades) absorbância controle baixo positivo
(unidades)
Os resultados das amostras foram classificados como negativo, positivo fraco, moderado ou forte, de acordo com os dados sugeridos pelo fornecedor, conforme especificado na Tabela 3.
TABELA 3 - RESULTADO DAS AMOSTRAS DE SOROS PARA O ANTI-CCP DE ACORDO COM AS UNIDADES OBTIDAS
RESULTADO UNIDADES
Negativa <20
Fracamente positiva 20 – 39
Moderadamente positiva 40 – 59
Fortemente positiva ≥ 60
FONTE: Inova Diagnostics Inc., (San Diego, USA)
4.3.4 Pesquisa do Fator Reumatóide
O FR-IgM foi investigado nas amostras através da técnica de aglutinação em látex, de acordo com PLOTZ e SINGER (1956), utilizando kits comerciais (BioSystems, S.A., Barcelona, Espanha). Essa se baseia na reação entre o FR presente nos soros teste e as partículas de látex de poliestireno sensibilizadas por IgG humana. Com a adsorção passiva de IgG às partículas do látex, ocorre exposição dos determinantes de IgG que reagem com o FR, resultando em uma reação de aglutinação. Na placa de precipitação são adicionados volumes iguais de soro e látex sensibilizado, homogeneiza-se por agitação, durante 2min. São consideradas positivas as amostras com nítida aglutinação, sendo essas, então,
diluídas em cloreto de sódio 0,9% e re-testadas para definição do título final da reação. Controles positivos e negativos foram incluídos em cada bateria de reação (Figura 19).
FIGURA 19 - AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX PARA A DETERMINAÇÃO DO FR
FONTE: O Autor (2009)
4.3.5 Pesquisa do anticorpo anti-nuclear (FAN)
Para a pesquisa do anticorpo FAN foram utilizados sistemas comerciais (Wama Diagnóstica, São Carlos, SP, Brasil). As amostras de soro foram diluídas à 1:80 e aplicadas em lâminas contendo como substrato células de cultura de tecido HEp-2, fixadas em cavidades, sendo incubadas por 30min. à temperatura ambiente. Após incubação e lavagem das lâminas por três vezes com tampão fosfato salina (PBS), procede-se nova incubação com conjugado (anti-IgG humana marcado com isotiocianato de fluoresceína), sob as mesmas condições. Em seguida, realiza-se nova lavagem e montagem das lâminas com glicerina tamponada.
A leitura feita em microscópio de fluorescência (Olympus, Japão), por dois observadores, independentemente, seguindo os critérios de leitura e caracterização dos padrões de fluorescência estabelecidos pelo II e III Consenso Brasileiro de FAN em células HEp-2 (DELLAVANCE et al., 2003; DELLAVANCE et al., 2009) (Figuras 20 e 21).
Positivo Negativo
FIGURA 20 - FAN: PADRÃO NULCEAR PONTILHADO FINO DENSO
LEGENDA: As células apresentam nucleoplasma com textura finamente pontilhada homogênea e placa metafásica corada na mesma textura.
FONTE: DELLAVANCE et al.,( 2009)
FIGURA 21 - FAN: PADRÃO NUCLEAR HOMOGÊNEO
LEGENDA: As células apresentam nucleoplasma fluorescente e nucléolo não visualizado pela sobreposição da coloração.
FONTE: DELLAVANCE et al.,( 2009)
Todas as amostras positivas nos testes de triagem foram re-testadas para definição do título final de auto-anticorpos. Consideram-se positivas as reações com títulos iguais ou superiores a 1:80.
Todas as amostras positivas para o FAN HEp-2 foram investigadas para a presença do anticorpo anti-dsDNA, por IFI (Biosystems, Barcelona, Espanha), empregando como substrato Crithidia luciliae. A diluição inicial de triagem foi 1:10.
4.3.6 Pesquisa de auto-anticorpos órgão específicos
As determinações dos auto-anticorpos AML, AMA, LKM, CGP e EmA-IgA foram realizadas por técnica de IFI, conforme metodologia previamente descrita (RIZZETO, SWANA, DONIACH, 1973; BIGAZZI, ROSE, 1984; VOLTA et al., 1995).
4.3.6.1 Preparo dos substratos
A pesquisa de auto-anticorpos órgão-específicos foi realizada através de técnica de IFI e envolveu os substratos representados no Quadro 4:
QUADRO 4 - AUTO-ANTICORPOS E RESPECTIVOS SUBSTRATOS ANTIGÊNICOS EMPREGADOS NAS REAÇÕES DE IFI
AUTO-ANTICORPOS SUBSTRATOS
Anti Músculo Liso Estômago de rato
Anti Mitocôndria Rim de rato
Anti LKM Rim e Fígado de rato
Anti Célula Gástrica Parietal Estômago de rato Anti Endomísio – IgA Cordão umbilical humano
FONTE: RIZZETTO, SWANA, DONIACH (1973); BIGAZZI, ROSE (1984); VOLTA et al., 1995
Para a obtenção dos órgãos de rato é necessária a aquisição de um animal de aproximadamente 4 meses, fêmea, fornecido pelo biotério da UFPR. O animal é mantido em jejum por 2 dias e, após sacrifício, realiza-se dissecção de estômago, rim e fígado, seguida de lavagem exaustiva soro fisiológico. Estes órgãos são clivados e imersos em OCT-Tissue Tek (Miles, USA) e rapidamente congelados em nitrogênio líquido (Figura 22). Os blocos são mantidos em freezer à -80°C até que
sejam feitos cortes criostáticos de 3µm de espessura (Reichert Histostat, USA). As lâminas contendo os cortes são mantidas à -20°C até o momento do uso nas reações.
FIGURA 22 - PREPARO DOS SUBSTRATOS UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE IFI
FONTE: O Autor (2009)
4.3.6.2 Reações de Imunofluorescência Indireta
Para a pesquisa dos auto-anticorpos AML, AMA, LKM e CGP as amostras foram diluídas à 1:20 e 1:40 em tampão PBS, pH 7.2. Os soros teste e controles positivos e negativos foram aplicados sobre as lâminas contendo os substratos específicos para cada auto-anticorpo, as quais foram incubadas por 30min. à temperatura ambiente. Após incubação e lavagem das lâminas com PBS, incubou- se novamente com conjugado fluorescente anti-Ig humana (GMK, Porto Alegre, RS) durante 30min. Em seguida, realizou-se a montagem das lâminas com glicerina alcalina.
A leitura foi realizada em microscópio de fluorescência (Olympus, Japão), por dois observadores, independentemente (Figura 23). O antígeno alvo do AML é a actina F do músculo, sendo a fluorescência detectada nas células da musculatura lisa de maneira uniforme ou granular (Figura 24). O AMA apresenta o complexo da enzima piruvato desidrogenase (70kDa e 48kDa) como antígeno alvo e cora intensamente o citoplasma de células epiteliais de túbulos distais (granular fino) e
das alças de Henle, e de forma mais fraca os túbulos proximais (Figura 25). O anti- LKM possui como antígeno alvo o retículo endoplasmático liso e rugoso (50kDa), e no fígado cora o citoplasma do hepatócito (granular fino difuso), enquanto no rim cora o epitélio renal tubular proximal (Figura 26). O anti-CGP tem como antígeno alvo as subunidades α e β da adenosina trifosfatase gástrica H/K (ATPase) e cora o citoplasma das células parietais da mucosa gástrica fúndica (Figura 27).
FIGURA 23 - MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA UTILIZADO NA LEITURA DAS REAÇÕES DE IFI
FONTE: O autor (2009)
Todas as amostras positivas nos testes de triagem foram re-testadas para definição do título final de auto-anticorpos. Considerou-se positivas as reações com títulos iguais ou superiores a 1:40 para AML e CGP, e iguais ou superiores a 1:20 para LKM e AMA.
FIGURA 24 - IFI PARA ANTICORPO AML
FIGURA 25 - IFI PARA ANTICORPO AMA
NOTA: Reação positiva Reação negativa
FIGURA 26 - IFI PARA ANTICORPO LKM
NOTA: Reação positiva Reação negativa
FIGURA 27 – IFI PARA ANTICORPO ANTI-CGP
4.3.6.3 Pesquisa do anticorpo anti-endomísio
O EmA-IgA foi investigado por IFI, utilizando-se como substrato cortes criostáticos de cordão umbilical humano, conforme descrito por LADINSER, ROSSIPAL e PITTSCHIELER (1994).
4.3.6.4 Preparo do substrato para o EmA-IgA
O cordão umbilical humano é obtido de gestantes sadias atendidas no Centro Obstétrico do Hospital de Clínicas da UFPR no momento do parto. Após a excisão do cordão, um pequeno fragmento deste é mergulhado em solução salina 0,9% e transportado ao Laboratório de Imunopatologia, onde é seccionado, transversalmente, em pequenos blocos. Esses são mergulhados em OCT-Tissue Tek (Miles, USA), e rapidamente congelados em nitrogênio líquido, sendo então mantidos à temperatura de -80°C. São realizados cortes criostáticos de 3µm de espessura (Reichert Histostat, USA) os quais são colocados sob lâminas de vidro e mantidos em freezer à -20°C até o momento de uso nas reações de IFI.
4.3.6.5 Reação de IFI para o EmA-IgA
As amostras de soro em estudo foram submetidas a diluição inicial de triagem (1/2,5) em tampão PBS, pH 7.2, e aplicadas sobre as lâminas contendo o substrato. Após incubação em câmara úmida (30 min., temperatura ambiente) e lavagem das lâminas com PBS (3 vezes, 5 min. cada vez), os cortes foram cobertos com o conjugado fluorescente anti-IgA humano (GMK, Porto Alegre,RS), previamente titulado. Procede-se nova incubação e lavagem das lâminas como já descrito, e montagem com glicerina alcalina.
As leituras foram realizadas em microscópio de fluorescência (Olympus, Japão; Figura 23), sendo consideradas positivas as amostras que caracterizassem fluorescência a partir da diluição 1/2.5, no tecido de endomísio (substância intermiofibrilar) que contorna as fibras de músculo liso na parede dos vasos e
artérias do cordão umbilical (Figura 28). Todos os soros positivos na diluição inicial de triagem são re-testados para definição do título final de anticorpos. Controles positivos e negativos foram incluídos em cada bateria de testes.
FIGURA 28 - IFI PARA ANTICORPO EmA-IgA
NOTA: Reação positiva Reação negativa
4.3.7 Correlação clínico-laboratorial
Os dados clínicos e demográficos dos pacientes e familiares, informados nos itens 4.2.1 e 4.2.2 respectivamente, foram avaliados e compilados através dos prontuários médicos e questionários aplicados no momento da coleta de sangue. Esses dados foram submetidos à análise visando associação com dados laboratoriais obtidos nas determinações séricas do anti-CCP, FR-IgM e demais auto- anticorpos investigados.
4.3.8 Análise estatística
Os resultados obtidos na determinação do anti-CCP, FR e outros auto- anticorpos foram organizados em planilhas, tabelas e gráficos, visando à análise dos dados e associação com parâmetros clínicos e demográficos dos pacientes com AR e familiares.
As análises de associação foram realizadas através de tabelas de contingência 2x2, aplicando-se testes do qui-quadrado com correção de Yates ou teste exato de Fisher, quando adequados. As comparações entre médias foram feitas através do teste de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis. O coeficiente de
correlação de Spearman foi utilizado para se determinar a significância de correlação entre variáveis e para se conhecer a sua magnitude. Para auxiliar tais análises foram utilizados os programas Statistica 5.5 (StatSoft) e Prism 4.0 (GraphPad Software).
A análise de variância multivariada foi empregada para interpretar e medir a correlação entre as variáveis do conjunto de dados, tendo-se optado por analisar todas juntas, o que permite ter a variável resposta (CCP e FR) incluída no gráfico. A análise de co-variância foi realizada visando aumentar a precisão na avaliação das estimativas de parâmetros.
A regressão logística dos dados permitiu fazer a análise das proporções, com cálculo do odds ratio, e intervalo de confiança de 95%, baseando-se em uma variável contínua e uma variável de categoria. Foram consideradas variáveis independentes sexo, tabagismo, idade de início de doença, tempo de duração de doença, classe funcional, nódulos reumatóides, síndrome de Sjögren e tireoidite. Como variáveis dependentes foram considerados CCP≥ 20U e FR≥ 30UI/ml. Para a análise multivariada, análise de co-variância e regressão logística foi utilizado o programa Statistica 8.0 (StatSoft). Valores de p menores que 0.05 foram considerados estatisticamente significativos.
5 RESULTADOS
Os resultados obtidos na investigação dos anticorpos anti-CCP, FR e demais auto-anticorpos em pacientes com AR, familiares e grupo de comparação encontram-se relacionados nos Apêndices 1, 2 e 3, respectivamente.
5.1 ANTICORPO ANTI-CCP E FR EM PACIENTES COM AR, FAMILIARES E GRUPO DE COMPARAÇÃO
Dentre os 156 pacientes com AR, 75% (117/ 156) apresentaram positividade para anti-CCP, enquanto FR foi positivo em 67.9% (106/ 156). Ambos diferiram significativamente do grupo de comparação, que apresentou positividade de 1% (1/ 100) para anti-CCP e 6% (6/ 100) para FR (p<0.0001 e p<0.0001 respectivamente). Nos familiares de pacientes com AR, observou-se elevação significativa na positividade do anti-CCP (5.5%; 11/ 200) em relação aos indivíduos sadios (1%; 1/100; p=0.050), enquanto para FR não foram observadas diferenças significantes entre ambos (8%, 16/200 vs. 6%, 6/100; p=NS). As comparações de freqüência do anti-CCP e FR entre pacientes e familiares também evidenciaram diferenças significativas (p<0.0001 e p<0.0001, respectivamente). O Gráfico 4 permite verificar a positividade para anti-CCP e FR nas amostras de pacientes com AR, familiares e grupo de comparação, bem como as análises entre os grupos.
Do total de 156 pacientes analisados para anti-CCP e FR, 60.9% (95/ 156) apresentaram positividade concomitante para ambos, 7% (11/ 156) foram positivos apenas para FR, 14.1% (22/ 156) apenas para anti-CCP e 17.9% (28/ 156) foram negativos para ambos (Gráfico 5a). Entre os familiares verificou-se 2.5% (5/ 200) de positividade concomitante para anti-CCP e FR, sendo a positividade isolada para apenas um desses auto-anticorpos igual a 5.5% (11/ 200) e 3% (6/ 200), respectivamente (Gráfico 5b).
Uma correlação significativa entre as concentrações de anti-CCP e os títulos de FR foi observada nos pacientes (r=0.43; p<0.0001; Teste de Spearman).
A sensibilidade e especificidade para anti-CCP, FR e anti-CCP/ FR concomitantes obtidas no presente estudo se encontram no Quadro 5.
GRÁFICO 4 - POSITIVIDADE PARA ANTI-CCP E FR NOS GRUPOS EM ESTUDO
NOTA: 1 Pacientes anti-CCP+ vs. Grupo de comparação anti-CCP+: p<0.0001 2 Pacientes anti-CCP+ vs. Familiares anti-CCP+: p<0.0001
3 Pacientes FR+ vs. Grupo de comparação FR+: p<0.0001 4 Pacientes FR+ vs. Familiares FR +: p<0.0001
5 Familiares anti-CCP+ vs. Grupo de comparação anti-CCP+: p=0.050. Teste de Fisher
GRÁFICO 5 – ANTI-CCP E FR EM PACIENTES COM AR E FAMILIARES
QUADRO 5 - SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA ANTI-CCP, FR E ANTI-CCP/ FR CONCOMITANTES Sensibilidade (%) Especificidade (%) Anti-CCP 75 99 FR 68 94 Anti-CCP/ FR 60 100 p=0.0505 p<0.00013, 4 p<0.00011,2 a) Pacientes b) Familiares
5.1.1 Positividade para anti-CCP e FR em pacientes com AR e familiares em relação ao sexo
Anti-CCP foi positivo em 74.3% (101/ 136) dos pacientes do sexo feminino e em 80% (16/ 20) do sexo masculino. De forma similar, 66.2% (90/ 136) dos pacientes do sexo feminino e 80% (16/ 20) do sexo masculino foram positivos para FR. Dentre os pacientes do sexo feminino, 58.8% (80/ 136) apresentaram positividade concomitante para anti-CCP/ FR, enquanto no sexo masculino, obteve- se 75% (15/ 20) de positividade concomitante. A comparação da freqüência entre sexo feminino e masculino não evidenciou diferença significativa nos grupos avaliados (Gráfico 6).
Em relação aos familiares do sexo feminino, 7.4% (9/ 122) foram positivos para anti-CCP e 10.6% (13/ 122) para FR. Nos familiares do sexo masculino a positividade foi de 2.6% (2/ 78) para anti-CCP e 3.8% (3/ 78) para FR. Dentre os familiares do sexo feminino, 4.1% (5/ 122) apresentaram positividade concomitante para anti-CCP/ FR em relação a 0% (0/ 78) do sexo masculino. Embora para anti- CCP não se obteve diferença significante, um aumento na positividade do FR e do anti-CCP/FR concomitantes foi observada nos familiares do sexo feminino, quando comparados ao masculino (p=0.067 e p=0.082, respectivamente; Gráfico 7).
5.1.2 Positividade para anti-CCP e FR em pacientes com AR e familiares em relação à idade
A faixa etária dos pacientes positivos para anti-CCP variou entre 24 e 84 anos (média = 52.6±12.4 anos) e para FR, entre 24 e 80 anos (média = 51.5±11.7anos). A média de idade dos pacientes positivos concomitantemente para anti-CCP/FR foi de 52.1±11.8 anos (24-80;Gráfico 8).
Por sua vez, a faixa etária dos familiares positivos para anti-CCP variou entre 16 a 65 anos (média = 39.4±15.9 anos), para FR de 8 a 70 anos (média = 39.7±13.7 anos) e para positividade concomitante de anti-CCP/ FR essa variou entre 25 e 46 anos (39.7±9.3 anos; Gráfico 8). Uma diminuição significativa na média de idade dos familiares em relação aos pacientes foi observada tanto para anti-CCP positivos (p=0.0081), como para FR (p<0.001) e CCP/FR concomitantes (p=0.0125).
GRÁFICO 6 – POSITIVIDADE PARA ANTI-CCP E/ OU FR EM PACIENTES COM AR DE ACORDO COM O SEXO
NOTA: Sexo feminino vs. Sexo masculino: p=NS para todos os grupos. Teste de Fisher
GRÁFICO 7 – POSITIVIDADE PARA ANTI-CCP E/ OU FR EM FAMILIARES DE ACORDO COM O SEXO
NOTA: 1 Anti-CCP+ Feminino vs. Masculino: NS 2 FR+ Feminino vs. Masculino: p=0.067
3 Anti-CCP/ FR+ Feminino vs. Masculino: p=0.082 Teste de Fisher
p=NS1
p=0.0672
GRÁFICO 8 – POSITIVIDADE PARA ANTI-CCP E/ OU FR DE ACORDO COM A MÉDIA DE IDADE
NOTA: * = Familiares
1 Pacientes anti-CCP+ vs. Familiares anti-CCP+: p=0.0081 2 Pacientes FR+ vs. Familiares FR+: p<0.001
3 Pacientes anti-CCP/ FR+ vs. Familiares anti-CCP/FR+: p=0.0125
5.1.3 Positividade para anti-CCP em pacientes com AR e familiares em relação ao grau de parentesco e tabagismo
A Tabela 4 sumariza a influência dos dados demográficos e sorológicos recém abordados, assim como do tabagismo, na positividade para anti-CCP e FR nos familiares de primeiro e segundo grau dos pacientes com AR.
Dentre os 188 familiares de primeiro grau, 5.3% (10/188) foram positivos para anti-CCP, 8% (15/188) para FR e 2.6% (5/188) para CCP/ FR concomitantes. Tais dados não diferiram significativamente daqueles obtidos para os familiares de segundo grau (8.3%, 1/12; 8.3%, 1/12 e 0%, 0/12, respectivamente).
Em relação ao tabagismo, dentre os 57 familiares fumantes (28.5%; 57/200), 5.3% (3/57) apresentaram positividade para anti-CCP e FR, e 1.8% (1/57) foram positivos para ambos, não apresentando diferença significativa entre os mesmos (Tabela 4; Gráfico 9).
p=0.00811 p<0.0012
TABELA 4 – DADOS DEMOGRÁFICOS E SOROLÓGICOS DOS FAMILIARES DE PACIENTES COM AR Familiares % (N) Anti-CCP + % (N) FR + % (N) Anti-CCP/ FR+ % (N) Idade média (faixa etária) 36.7 (7 – 91) 39.4 (16 –65) 39.7 (8 – 70) 39.7 (25 – 46) Feminino 61 (122/ 200) 7.4 (9/ 122)1 10.6 (13/ 122)2 4.1 (5/ 122)3 Masculino 39 (78/ 200) 2.6 (2/ 78) 3.8 (3/ 78) 0 (0/ 78) Familiar de 1º grau 94 (188/ 200) 5.3 (10/ 188)1 8 (15/ 188)1 2.6 (5/ 188)1 Familiar de 2º grau 6 (12/ 200) 8.3 (1/ 12) 8.3 (1/ 12) 0 (0/ 12)1 Fumantes 28.5 (57/ 200) 5.3 (3/ 57)1 5.3 (3/ 57)1 1.8 (1/ 57)1 NOTA: 1 Feminino vs. Masculino; Familiar de 1º grau vs. Familiar de 2º grau; Fumantes vs. Não-
fumantes: p=NS
2 FR+ Feminino vs.Masculino: p = 0.067
3 Anti-CCP/ FR+ Feminino vs. Masculino: p = 0.082 Teste de Fisher
Por sua vez, dentre os pacientes com AR tabagistas (44%; 63/143), 73% (46/63) foram anti-CCP positivos, 65.1% (41/63) FR positivos e 58.7% (37/63) apresentaram anti-CCP/FR concomitantes. A análise da freqüência desses anticorpos em fumantes e não fumantes não evidenciou diferença significativa (Gráfico 9).
5.1.4 Positividade para anti-CCP em pacientes com AR e familiares em relação aos títulos de anticorpos
A distribuição dos anticorpos anti-CCP nos indivíduos em estudo pode ser observada no Gráfico 10.
GRÁFICO 9 - POSITIVIDADE PARA ANTI-CCP E FR DE ACORDO COM O TABAGISMO
NOTA: Familiares tabagistas vs. familiares não tabagistas (CCP, FR, CCP/FR): p=NS Pacientes tabagistas vs. pacientes não tabagistas (CCP, FR, CCP/ FR): p=NS Teste Qui-quadrado com correção de Yates e Fisher
GRÁFICO 10 – DISTRIBUIÇÃO DOS TÍTULOS DE ANTI-CCP NOS GRUPOS EM ESTUDO
A concentração do anti-CCP nos pacientes positivos (117/ 156) apresentou variação de 21 a 254U (média 140U±75.7) e nos familiares (11/ 200) de 20 a 234U (média 115.6 ± 84.2), e na única amostra positiva no grupo de comparação observou-se No grupo de comparação a única amostra positiva caracterizou 24U. Por sua vez, nos pacientes negativos para anti-CCP a variação foi de 6 a 19U
FAMILIARES PACIENTES
Cut-off
(média = 10.9U) e nos familiares de 7 a 19U (média = 9.9U). Não foram observadas diferenças significantes na média das concentrações de anti-CCP positivo (p=0.3078) e anti-CCP negativo (p=0.5947) entre pacientes e familiares (Gráfico 11).
Do total de 117 pacientes positivos para, 76.9% (90/ 117) apresentaram reação fortemente positiva, 8.5% (10/ 117) moderadas e 14.5% (17/ 117) fracamente positivas (Gráfico 12a).
GRÁFICO 11 – DISTRIBUIÇÃO DOS TÍTULOS DE ANTI-CCP EM PACIENTES COM AR E FAMILIARES