Docking molecular entre AraN-Arabinotriose

Na figura II.38 encontram-se os dockings das conformações 6 e 7 respectivamente na estrutura da AraN obtida anteriormente no servido I-TASSER. A conformação 6 foi escolhida visto que é aquela em que a arabinotriose se encontra a interagir com o resíduo W253 conservado na família de SBP’s e envolvido no processo de reconhecimento de substratos (figura II.34, mostra que estes resíduo é conservado em todas as proteínas submetidas a alinhamento). A conformação 7 foi escolhida por razões semelhantes visto ser a única na qual a arabinotriose se encontra a interagir com o resíduo R81 da AraN, sendo também este resíduo conservado em algumas SBP’s encontrando-se a interagir com o substrato (figura II.35).

Figura II.38. Conformações obtidas no docking molecular. Na figura à esquerda está representado o docking

AraN-Arabinotriose da conformação 6 e na figura à direita está representado o docking da AraN-arabinotriose da conformação 7.

Através da análise de ambos os dockings das conformações 6 e 7 (figura II.38), é possível observar que o local de ligação escolhido é distinto. Relativamente, à conformação 6 parece haver uma maior exposição do açúcar ao solvente, ao passo que na conformação 7 a arabinotriose está mais estabilizada numa das “encostas” da AraN. O docking com as interações referente à conformação 6 está representado na figura II.39.

Figura II.39. Mapeamento de interacções. Interações AraN-arabinotriose (conformação 6). As figuras têm uma

orientação relativa entre elas de 1800.

Na figura II.39 é possível observar que tal como foi previamente observado para outras proteínas a arabinotriose encontra-se estabilizada por três interações hidrofóbicas por CH-stacking,

com os resíduos W253, Y254 e Y54. Relativamente ao Y254 este é o resíduo que através da análise da figura II.39 se encontra em maior proximidade com o receptor molecular, estando 0.8 Å do H4α da subunidade redutora. Este resultado vai ao encontro dos resultados obtidos através do mapeamento de epítopos com recurso ao calculo do STDfit (II.3.3.1).

Ainda no que diz respeito à subunidade redutora, esta encontra-se envolvida na formação de duas pontes de hidrogénio com a AraN. Estas pontes de hidrogénio são mediadas através do carboxilo da cadeia lateral da E175 com o –OH3, tendo esta ponte de hidrogénio 2.0 Å, bem como pela ponte de hidrogénio (2,0 Å) entre o carboxilo da cadeia lateral do D178 com o –OH1. Este dados estão de acordo com os resultados obtidos por STD-RMN, no qual o protão H3α da arabinotriose apresenta uma saturação de 35%. A percentagem de saturação do protão H1α foi de 25%, no entanto a análise deste último protão não pode ser tida em conta visto que o espectro foi obtido através de um sequencia pulso que ao suprimir o sinal residual da água pode irradiar em parte este protão face à sua proximidade do sinal da água.

Os estudos da secção II.3.3.4.3, levantaram a hipótese de na arabinotriose o sinal que maior ASTD apresenta é aquele relativo aos protões H2m e H2n. Se tivermos em conta que este

mapeamento traduz a proximidade entre a arabinotriose e a AraN, e que um maior afastamento do receptor molecular irá levar em última análise a uma menor transferência de saturação e consequentemente um menor ASTD, podemos à partida através da análise da figura II.40 demonstrar

que o protão H2m se encontra virado para uma região onde não se encontra a estabelecer contactos com a AraN. Por outro lado o protão H2n fica virado para uma região interna da AraN, nomeadamente para o lado do anel aromático do W253, pese embora esteja a distancia de 3,2 Å da cadeia lateral do resíduo W253. Esta distancia é 4 vezes superior à distancia relativa entre o protão H4α da subunidade redutora e o resíduo Y254. Assim e de acordo com o modelo obtido por docking faria mais sentido que o protão que se encontra-se a receber maior saturação fosse o protão H4α, algo que pode ser suportado através da análise da figura II.40, que sugere uma maior proximidade da subunidade redutora para com a AraN, fruto das interações que estabelece com o último por pontes de hidrogénio.

Assim pese embora as três subunidades que compõem a arabinotriose apresentem um conjuntos de interações fundamentais no processo de reconhecimento molecular, seria mais espectável que o epítopo de ligação que apresentasse um maior grau de saturação fosse o H4α, como é explicado na secção II.3.3.1 este facto pode dever-se ao facto do protão H4α apresentar um T1 mais curto sendo que o ASTD retirado no mapeamento de epítopos, que é efectuado com um tempo

de saturação de 1,5 segundos, pode estar a subvalorizar o ASTD deste protão.

Ainda relativamente a interação da AraN com a arabinotriose é possível observar a presença de um terceiro resíduo aromático próximo da subunidade não redutora da arabinotriose Y54, sendo que este resíduo é putativo de se encontrar a estabelecer uma interação CH-stacking, com um dos CH da subunidade não redutora. O docking efectuado não atribuiu liberdade conformacional ao receptor molecular, sendo que numa segunda etapa a execução de docking com os resíduos até aqui identificados pode revelar a interação CH-stacking entre a Y54 e –CH do subunidade n do açúcar. Ainda nesta subunidade é possível constatar a formação de uma ponte de hidrogénio de 1,8 Å entre o

resíduo E78 e o grupo –OH ligado ao C5 da subunidade final não redutora. A proximidade desta subunidade ao receptor molecular é também ela suportada pelos dados de STD-RMN que revelam que o CH2 que maior saturação recebe por parte da AraN é o da subunidade não redutora com um grau de saturação de 62%.

No que diz respeito a outras SBP’s estas reconhecem o açúcar através da sua ligação longitudinalmente ao longo de um local de ligação afilado ao longo da cavidade. Sendo que no caso da AraN a arabinotriose é reconhecida horizontalmente ao longo do local de ligação o que revela que ou por uma lado o local de ligação é mais largo, ou a AraN obtida nos modelos de homologia se encontra na sua conformação aberta. Este último argumento pode ser suportado devido ao facto da proteína estar a estabelecer maioritariamente interações com o domínio N-terminal através dos resíduos E175, D178, W253 e Y254, ao passo que apenas as interações promovidas pelos resíduos E78 e Y54 é que pertencem ao domínio C-terminal [129].