EFEITO DA AGMATINA SOBRE A ATIVIDADE IN VITRO DAS ENZIMAS MONOAMINO OXIDASES A E B

Como pode ser observado na Figura 16, a agmatina não inibiu em nenhuma concentração testada, a atividade das enzimas monoamino

oxidase A [t=1,30; P = 0,25; Teste “t” de Student] e monoamino oxidase B [t=0,96; P = 0,38; Teste “t” de Student], quando comparadas ao grupo controle. Dessa maneira a agmatina não interfere com a metabolização

do MPTP a MPP+. 0.01 0.1 1 10 100 1000 0 20 40 60 80 100 120 140

MAO-B

MAO-A

Agmatina ( M)

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Figura 16: Efeito da agmatina (0,01 – 1000 µM) sobre a atividade das enzimas monoamino oxidases A e B in vitro. Os dados estão representados por porcentagem de atividade comparada ao grupo controle e foram obtidos a partir de experimentos em duplicata.

5 DISCUSSÃO

Os resultados do presente estudo confirmam achados prévios do nosso grupo (PREDIGER et al., 2010) demonstrando que a administração i.n. de MPTP promove alterações da memória operacional em camundongos. Além disso, os presentes resultados indicam pela primeira vez uma maior suscepbtibilidade de camundongos envelhecidos (15 meses de idade) fêmeas aos prejuízos motores induzidos pela administração i.n. de MPTP. De maior destaque, o presente estudo sugere de maneira inédita o efeito protetor do tratamento repetido com agmatina sobre os prejuízos cognitivos, motores e neurológicos induzidos pela administração i.n. de MPTP em camundongos.

No presente estudo, foi demonstrado que a agmatina possui duas características importantes que devem ser ressaltadas. A primeira é que a agmatina não interfere com a cinética de metabolização do MPTP, uma vez que não inibiu a atividade das enzimas monoamino oxidases A e B, permitindo dessa maneira que o MPTP seja convertido no seu

metabólito ativo MPP+ e exerça sua neurotoxicidade esperada. A

segunda é que a agmatina previne de modo eficiente a morte dos animais, aumentando a porcentagem de sobrevida, além de não interferir com o peso dos mesmos durante o período de tratamento.

Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que o tratamento repetido durante 5 dias com agmatina por via i.p. não gerou alterações no peso nos animais, sugerindo um padrão normal de ingestão alimentar. Além disso, trabalhos prévios da literatura demonstraram que o tratamento repetido com agmatina (uma vez ao dia durante 7 dias), através de cânula guia implantada no terceiro ventrículo não gerou prejuízos na atividade locomotora dos animais (KOTAGALE et al., 2010; LIU et al., 2008a).

Os sistemas de neurotransmissão dopaminérgico e glutamatérgico estão amplamente distribuídos em diversas regiões encefálicas como córtex, sistema límbico e núcleos da base, nos quais atuam de maneira integrada para realizar funções na motivação e no processamento de informações associativas (KELLEY, et al., 2003). Acredita-se que a atividade neural coordenada entre esses dois sistemas seja realizada principalmente através dos receptores D1 para dopamina e NMDA para glutamato. Esses receptores estão relacionados a eventos como transdução de sinal e transcrição gênica que conduzem a alterações de

longa duração na expressão de genes, plasticidade sináptica e, consequentemente, a comportamentos relacionados com os sistemas citados (KELLEY, et al., 2003).

Trabalhos anteriores já investigaram se o bloqueio dos receptores NMDA causaria algum tipo de prejuízo no aprendizado instrumental alimentar. Nestas pesquisas, experimentos foram realizados para investigar o comportamento alimentar dos animais e sua atividade locomotora, uma estratégia para validar os resultados do aprendizado. A administração de AP-5 (antagonista do receptor NMDA para glutamato) no núcleo central da amígdala gerou prejuízos nos padrões de ingestão alimentar e também na atividade locomotora, apesar de outros trabalhos não evidenciarem tais características em diferentes regiões cerebrais,

apenas mostrando prejuízo no aprendizado instrumental

(GALLAGHER; SCHOENBAUM, 1999; ABEL; LATTAL, 2001).

Desta maneira, a neurotransmissão envolvida com o

comportamento de ingestão alimentar, bem como a atividade locomotora dos animais, parece não estar diretamente afetada devido ao tratamento repetido com a agmatina. Portanto, a agmatina parece apresentar uma ação moduladora prevalente, não evidenciando prejuízos comportamentais per se. Essa característica moduladora já foi confirmada em diferentes estudos. No labirinto aquático de Morris, a agmatina gerou benefícios na memória espacial de trabalho e não interferiu com a memória espacial de referência (LIU; BERGIN, 2009). Os níveis endógenos de agmatina mostraram-se aumentados no hipocampo de ratos submetidos a esse mesmo teste, sugerindo uma relevância da liberação desta substância nesse tipo de aprendizado espacial. De maneira importante, nos animais submetidos somente a tarefa de nadar tal aumento não foi verificado (LIU et al., 2008b). Outro trabalho observou um efeito facilitador da agmatina na consolidação no teste da esquiva inibitória do tipo step-down quando administrada imediatamente após a sessão de condicionamento, porém, não foi observado o mesmo efeito na aquisição da memória, isto é, quando administrada uma hora antes da sessão de treino (ARTENI et al., 2002). Outros efeitos benéficos da agmatina já foram evidenciados em trabalhos que avaliaram suas ações em parâmetros de emocionalidade. Em testes utilizados para a avaliação de propriedades ansiolíticas de substâncias, a agmatina mostrou esse caráter no labirinto em cruz elevado, na caixa claro escuro, no teste de conflito de Voegel e na interação social (LAVINSKY; ARTENI; NETTO, 2003; GONG et al.,

2006). Quando avaliada sua propriedade antidepressiva, a agmatina mostrou-se efetiva tanto no teste de suspensão pela cauda quanto no teste do nado forçado (GONG et al., 2003). Além disso, no teste do nado forçado, a agmatina foi capaz de potencializar o efeito de antidepressivos clássicos como a fluoxetina e a paroxetina (KRASS et al., 2008). De maneira importante, substâncias que aumentam os níveis endógenos de agmatina como a L-arginina, o inibidor de ornitina descarboxilase entre outros, apresentaram o mesmo efeito no referido teste (TAKSANDE et al., 2009).

Através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa um grupo de pesquisadores neozelandeses quantificou os níveis de agmatina em diversas regiões cerebrais. Tal estudo evidenciou diminuição dos níveis de agmatina na região CA1 do hipocampo e no córtex pré-frontal de ratos idosos (LIU et al., 2008c). No entanto, este mesmo estudo verificou aumento dos níveis de agmatina no giro denteado, nos córtices entorrinal, perirrinal e temporal dos ratos envelhecidos (Liu et al., 2008c)

Por se tratar de uma substância endógena com características moduladoras e que o envelhecimento altera suas concentrações em diferentes regiões cerebrais buscou-se avaliar os efeitos do tratamento repetido com agmatina em um modelo experimental da DP aplicado em

animais envelhecidos. De maneira interessante, embora o

envelhecimento represente o principal fator de risco para o desenvolvimento da DP, poucos estudos utilizando modelos experimentais da DP têm sido conduzidos em animais envelhecidos, sendo esta uma importante limitação dos estudos pré-clíncos na DP.

O pré-tratamento com agmatina foi realizado na tentativa de observar os efeitos moduladores e protetores no modelo de administração i.n. de MPTP em camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 com 15 meses de idade. Conforme já descrito anteriormente, a toxicidade do MPTP aumenta com o envelhecimento, bem como já foi evidenciado que camundongos fêmeas são mais sensíveis a toxicidade induzida pelo MPTP (ANTZOULATOS et al., 2010; DESOLE et al., 1993; OVADIA; ZHANG; GASH, 1995). Entretanto, deve ser mencionado que existem resultados contraditórios na literatura mostrando uma maior sensibilidade de camundongos machos à toxicidade induzida pelo MPTP (SEDELIS et al., 2000). Outro ponto importante que pode contribuir para o aumento da toxicidade do MPTP, é que a expressão da enzima MAO-B encontra-se aumentada em diversas regiões cerebrais incluindo núcleos da rafe, lócus coeruleus e núcleo paraventricular do tálamo em roedores idosos (SAURA;

RICHARDS; MAHY, 1994), possivelmente elevando a

biotransformação central do MPTP, gerando uma maior taxa de MPP+

circulante no SNC.

Devido a sua alta lipossolubilidade, o MPTP se difunde rapidamente pelas barreiras celulares sendo convertido a sua forma tóxica MPP+ principalmente em astrócitos através da ação da enzima

MAO-B. O MPP+ é uma toxina que possui uma toxicocinética rápida e

eficaz, sendo que em ratos a mesma pode atingir sua concentração cerebral máxima 90 minutos após administração sistêmica (JACKSON- LEWIS; PRZEDBORSKI, 2007). De acordo com resultados prévios da literatura (GILAD et al., 2005), no presente estudo confirmou-se que a agmatina não interfere com a cinética de biotransformação do MPTP, permitindo que este seja convertido em MPP+ e exerça a sua esperada toxicidade sobre neurônios dopaminérgicos.

No presente estudo, verificou-se que o pré-tratamento com agmatina foi capaz de prevenir a redução na porcentagem de sobrevida dos animais tratados com MPTP. A análise da porcentagem de sobrevida mostra também que o pré-tratamento com agmatina não foi capaz de prevenir a toxicidade aguda induzida pelo MPTP. Os efeitos tóxicos verificados nos momentos iniciais após a administração do MPTP parecem estar relacionados com ações periféricas da toxina sobre

o sistema cardiovascular e na indução de hipotermia

(FREYALDENHOVEN; ALI.; HART, 1995). De maneira importante, tem sido demonstrado que mesmo após a administração pela via i.n., uma parcela da droga é deglutida pelos animais sendo distribuída perifericamente (DHURIA; HANSON; FREY II, 2010). Dessa maneira, uma liberação excessiva de noradrenalina seria gerada por ação do

MPTP/MPP+, seguida de sua depleção nos terminais nervosos

simpáticos (FULLER et al., 1984; LUTHMAN; JONSSON, 1986). A

liberação excessiva de noradrenalina gera um quadro de

superestimulação cardíaca, promovendo também uma vasoconstrição generalizada, culminando com um colapso cardiovascular. Estudos prévios em órgão isolado demonstraram que a agmatina não foi capaz de interferir com a ação da noradrenalina (GONZALEZ et al., 1996; ÖZYAZGAN et al., 2003). Além disso, a agmatina não exibiu efeitos per se na temperatura retal de roedores. Pelo contrário, em quadros de hipertermia induzida por lipopolissacarídeo (LPS), apresentou ações de reduzir a temperatura por inibir a produção de nitritos e a morte neuronal induzida pelo LPS ( ABE; ABE; SAITO, 2000; ARICIOGLU;

REGUNATHAN,, 2005; RAWLS; AMIN; ZISK, 2007). De acordo com a literatura e com os dados de sobrevivência do estudo atual, a agmatina parece não atuar na toxicidade periférica aguda do MPTP.

O efeito da agmatina em diminuir a mortalidade induzida pelo tratamento com MPTP foi verificado somente após 14 dias da administração i.n. desta toxina, evidenciando ação protetora em algum alvo que possua efeitos relacionados com a toxicidade desencadeada

pelo MPP+ a longo prazo. Ao término dos 26 dias do protocolo

experimental, o grupo agmatina/MPTP apresentou 81% de sobrevida, o que é significativamente maior do que 40% do grupo controle/MPTP.

Tanto o MPP+ quanto o pesticida rotenona possuem como

mecanismo desencadeador de toxicidade a inibição irreversível do complexo I mitocondrial. Essa ação gera efeitos de desestabilizar as funções mitocondriais levando a produção de radicais livres, ativação de vias apoptóticas entre outros mecanismos já citados (BEAL, 2001). Um trabalho recente utilizando a rotenona demonstrou que a agmatina pode atuar nestes parâmetros e desta maneira reduzir a sua neurotoxicidade (CONDELLO et al., 2010). Nesse mesmo estudo, quando testada em cultura de células SH-SY5Y, a agmatina foi capaz de prevenir parcialmente alterações no potencial de membrana mitocondrial, formação de radicais livres, ativação de vias apoptóticas e aumentou a viabilidade celular induzidas pela rotenona (CONDELLO et al., 2010). Desta forma, no presente estudo a agmatina pode ter atuado na manutenção das funções mitocondriais perante a toxicidade do

MPTP/MPP+ e retardar os prejuízos comportamentais observados, além

de aumentar a porcentagem de sobrevida dos animais. Entretanto experimentos adicionais são necessários para confirmar esta hipótese que até o momento é meramente expeculativa.

Diversos trabalhos têm investigado os mecanismos bioquímicos envolvidos com a toxicidade induzida pelo MPTP (PERRY et al., 1985; PRZEDBORSKI et al., 1992; FRANCO et al., 2007). Neste sentido, o envolvimento dos sistemas glutamatérgico e nitrérgico vem sendo caracterizado nesse modelo experimental de DP. Estudos em cultura de células já evidenciaram o componente glutamatérgico na toxicidade induzida pelo MPTP através de prejuízos na captação de glutamato em astrócitos (HAZELL et al., 1997; DI MONTE; TOKAR; LANGSTON, 1999). Além disso, pesquisas avaliando o estresse oxidativo gerado pelo MPTP demonstram que a toxina estaria agindo através da disfunção de transportadores glutamatérgicos e ativação da nNOS (AOYAMA et al., 2008).

Um estudo recente verificou alterações na sinalização glutamatérgica que estariam contribuindo para a degeneração dopaminérgica na SNpc de camundongos após a administração sistêmica de MPTP (MEREDITH et al., 2009). Pesquisas realizadas através da administração de memantina, um antagonista dos receptores NMDA para glutamato, demonstraram que a mesma possui efeitos antiparkinsonianos em animais de laboratório e que em um teste clínico mostrou-se bastante eficaz para os pacientes portadores de demência com Corpos de Lewy (FREDRIKSSON et al., 2001; AARSLAND et al., 2009).

A agmatina evidenciou também efeito anticonvulsivante em uma série de trabalhos, tanto em convulsões induzidas por pentilenotetrazol e glutamato (FENG; LEBLANC; REGUNATHAN, 2005) quanto por eletrochoque (SU et al., 2004). Esses trabalhos sugerem que esses efeitos anticonvulsivantes sejam mediados por inibição da nNOS e ativação dos receptores α2-adrenérgicos (DEMEHRI et al., 2003). Uma característica importante é que a agmatina reduz as concentrações extracelulares de glutamato após as convulsões induzidas por pentilenotetrazol, sendo possivelmente um importante mecanismo para essa proteção contra as crises convulsivas, além de aumentar as propriedades anticonvulsivantes do valproato e do fenobarbital (LUSZCZKI et al., 2008; LUSZCZKI et al., 2009).

Dessa maneira, emerge a possibilidade de que a agmatina poderia também agir através do antagonismo dos receptores NMDA e da inibição das isoformas I e II da NOS para gerar seus efeitos de proteção observados no modelo da DP utilizado no presente estudo. Alguns trabalhos já evidenciaram que neurotoxinas utilizadas em modelos experimentais de DP, incluindo o MPTP, são capazes de alterar o funcionamento do sistema glutamatérgico em cultura de células e na substância negra de camundongos C57BL/6 (YANG et al., 2005; MEREDITH et al., 2009). Porém os resultados atuais demonstram pela primeira vez que o MPTP em um ensaio ex vivo consegue diminuir a captação de glutamato 21 dias após sua administração. Dessa maneira, reforça-se a idéia do envolvimento do sistema glutamatérgico na progressão dos efeitos observados no modelo de DP em questão. A diminuição da captação de glutamato revela alteração de um mecanismo importante para a retirada do glutamato da fenda sináptica (FRIZZO et al., 2002). Assim teoricamente uma elevada concentração de glutamato permaneceria por um maior período de tempo exercendo suas ações,

podendo induzir um quadro de excitotoxicidade, como já mencionado anteriormente (CHOI, 1992). Um possível comprometimento das funções hipocampais dos camundongos idosos, poderia ser gerado pela administração i.n. de MPTP. No entanto experimentos adicionais são necessários para a verificação desses prejuízos durante os 21 dias após administração i.n. de MPTP. Com essa estratégia seria possível realizar a correlação entre esse parâmetro neuroquímico e os comprometimentos comportamentais que foram observados ao longo do protocolo experimental. Entretanto, de maneira inesperada, a agmatina não foi capaz de previnir a diminuição da captação de glutamato em fatias hipocampais de camundongos idosos gerada pela administração i.n. de MPTP. Portanto, embora a excitotoxicidade glutamatérgica pareça contribuir para a toxicidade induzida pela administração i.n. de MPTP, este parece não representar o mecanismo principal pelo qual a agmatina exerce seu efeito protetor no presente modelo. Entretanto, estudos adicionais avaliando os efeitos da agmatina e do tratamento i.n. de MPTP sobre a recaptação de glutamato em outros tempos e em outras áreas cerebrais de camundongos bem como sobre a expressão dos transportadores de glutamato estão em andamento em nosso laboratório e poderão contribuir com esta discussão.

A análise do componente cognitivo foi realizada 7 dias após a administração i.n. de MPTP, utilizando-se o teste de reconhecimento social, previamente padronizado em nosso laboratório (PREDIGER et al., 2010). Este teste é utilizado para a verificação da memória olfatória de curta duração, sendo que drogas ou procedimentos que reconhecidamente interferem com os processos de aprendizado e memória, promovem alterações significativas neste teste (PERIO et al., 1989; PREDIGER et al. 2004, 2005). Já foi demonstrada a importância da dopamina para o processamento da memória olfatória, visto o aumento de sua liberação durante o aprendizado olfatório (COOPERSMITH et al., 1991). Aliado a isso, o tratamento com antagonistas dos receptores dopaminérgicos (PREDIGER et al., 2004) ou substâncias que prejudicam a neurotransimissão dopaminérgica como a reserpina (PREDIGER et al., 2005) ou o MPTP (MOREIRA et al., 2010; PREDIGER et al., 2010), induzem um prejuízo da memória social de curta duração.

De acordo com os resultados obtidos anteriormente (PREDIGER et al., 2010) camundongos tratados com MPTP pela via i.n. apresentaram prejuízos no reconhecimento social, evidenciado por um tempo de investigação semelhante nas duas exposições do mesmo animal jovem, sendo observado um RDI próximo a um (01). Os

resultados obtidos no presente estudo evidenciam uma característica protetora importante da agmatina sobre a função cognitiva dos camunongos infundidos com MPTP, uma vez que o grupo agmatina/MPTP não apresentou prejuízo na memória olfatória de curta- duração. Corroborando estes resultados, a característica protetora da agmatina em testes cognitivos também já foi evidenciada em um estudo prévio utilizando o peptídeo beta-amilóide 23-35 (Aβ25-35) em camundongos, um modelo experimental da doença de Alzheimer. Nesse trabalho, a agmatina foi capaz de previnir os prejuízos gerados pelo peptídeo Aβ25-35 em camundongos na memória espacial de trabalho no labirinto aquático de Morris, no teste de reconhecimento de objeto e também na memória de referência no labirinto radial (BERGIN; LIU, 2010).

O Escore Neurológico de Severidade (ENS) foi utilizado para avaliar o estado neurológico geral dos animais 13 dias após a administração de MPTP pela via i.n.. Como já descrito, o ENS é composto de uma série de tarefas que avaliam tanto a atividade

locomotora e equilíbrio quanto a agilidade dos animais

(SCHWARZBOLD et al., 2010). A presente escala foi recentemente padronizada em nosso laboratório para a avaliação neurológica de animais submetidos a um modelo experimental de traumatismo crânio encefálico (TCE) (SCHWARZBOLD et al., 2010).

Os resultados do presente trabalho demonstram que os animais submetidos à administração i.n. de MPTP apresentam um prejuízo significativo na execução das tarefas do ENS e que o pré-tratamento com agmatina foi capaz de prevenir tais alterações. Como possível mecanismo para esse efeito, sugere-se que através do antagonismo dos receptores NMDA e da inibição da nNOS e da iNOS, a agmatina esteja impedindo que o glutamato e o NO, gerados pela administração do MPTP, exerçam seus efeitos neurotóxicos. De acordo com esta hipótese, já foi demonstrado que a agmatina gerou efeito protetor quando administrada imediatamente após um modelo experimental de TCE, inibindo o aumento de glutamato e NO no hipocampo dos animais submetidos ao trauma (KUO et al., 2007).

Como descrito na introdução, os efeitos da administração i.n. de MPTP sobre a atividade locomotora de roedores variam de acordo com a espécie utilizada (PREDIGER et al., 2006; MOREIRA et al., 2010; PREDIGER et al., 2010). No presente estudo, a atividade locomotora foi

avaliada em diferentes tempos e em diferentes testes, para evitar o descrito efeito de habituação (WALSH; CUMMINS, 1976).

Neste momento deve ser ressaltado que os sintomas motores não são observados nos estágios iniciais da DP, sendo que estes somente aparecem com o avanço da doença quanto aproximadamente 60-70% dos neurônios dopaminérgicos da SNpc encontram-se degenerados (CHAUDHURI; HEALY; SCHAPIRA, 2006). Consistente com estas observações clínicas, três dias após a administração i.n. do MPTP não foi verificado nenhum comprometimento da função motora dos animais quando estes foram avaliados na caixa de locomoção, o que está de acordo com resultados prévios do nosso grupo. Tanto ratos quanto camundongos, quando infundidos com MPTP pela via i.n. não apresentam tais déficits nos estágios iniciais do protocolo experimental (PREDIGER et al., 2006; PREDIGER et al., 2010).

Treze dias após a infusão i.n. de MPTP, os prejuízos locomotores começaram a aparecer em camundongos envelhecidos, como foi evidenciado pelo ENS. De maneira importante, o pré-tratamento com agmatina foi capaz de prevenir os déficits gerados pelo MPTP e aferidos nessa escala.

No teste do campo aberto, que foi realizado 19 dias após a administração i.n. do MPTP, não foi evidenciado efeito protetor da agmatina quando se avalia o número de cruzamentos. Entretanto, quando se avalia a atividade exploratória do animal através do número de levantamentos, a agmatina foi capaz de gerar um efeito protetor nesse parâmetro. No presente protocolo experimental, o prejuízo da função locomotora foi sendo evidenciado com o passar do tempo após a administração do MPTP pela via i.n., caracterizando um prejuízo tardio. Tal resultado não foi observado pelo nosso grupo em camundongos adultos jovens (5 meses de idade) infundidos com MPTP pela via i.n. (PREDIGER et al., 2010). Assim, os camundongos com 15 meses de idade parecem apresentar uma maior sensibilidade aos efeitos da toxina. Um trabalho realizado com macacos observou que conforme a idade dos animais aumentava, a administração de uma dose menor de MPTP era necessária para gerar os mesmos prejuízos motores (OVADIA; ZHANG; GASH et al., 1995). Outros trabalhos já evidenciaram que a administração do MPTP em animais idosos gera uma maior depleção de dopamina e um aumento da formação de radicais livres quando comparado a animais jovens (ALI et al., 1994; TSAI; TSAI; TAI, 1994). Dessa maneira, parece que o fator idade é também importante para o surgimento de prejuízos motores no modelo da administração i.n. de MPTP. Os resultados reproduziram o agravo da função locomotora, que

é observado na clínica nos pacientes portadores da DP, ou seja,