Efeito de FDM1,0 e F1 sobre a capacidade redutora do MTT a

O efeito dos polissacarídeos sulfatos da alga marrom Dictyota menstrualis sobre a redução do MTT a formazan nas linhagens celulares B16-F10 e 786-O foi avaliado sob a ação de diferentes massas 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 µg em dois tempos diferentes (24 e 48h). O ensaio é baseado no fato de que o brometo de tetrazólio indica a atividade de enzimas desidrogenases presentes em mitocôndrias de células vivas, uma vez que o anel tetrazólio seria clivado por elas, portanto, isso daria uma indicação de células funcionais (MOSMANN, 1983).

Quanto à linhagem B16-F10, tanto FDM1,0 quanto F1 nas condições testadas causaram diminuição na redução do MTT a formazan. No tratamento de 24h, 100 µg de FDM1,0 promoveu intensa diminuição na redução do MTT a formazan, com

moderada e baixa interferência na redução do MTT a formazan nas outras massas avaliadas. Embora FDM1,0 tenha apresentado maior atividade inibitória sobre as células do que F1, quando comparada a mesma massa aplicada entre as frações, somente foi observada diferença estatística em 40 e 100µg (figura 15.A). Entre as massas testadas da mesma fração poucas se distinguiram estatisticamente, tanto em FDM1,0 quanto em F1.

No tratamento de 48h (figura 15.B), não foi observada diferença estatística entre as frações quando comparada a mesma massa aplicada, assim como também entre as diferentes massas de cada fração individual. O efeito de ambas as frações sobre a linhagem B16-F10 foi leve a moderado, com 48h de tratamento obteve-se o melhor resultado com 50 µg de FDM1,0, cuja redução do MTT foi de apenas 39%. Quando comparada a mesma massa entre tempos diferentes, apenas 100µg de FDM1,0 e 20 e 30 µg de F1 apresentaram diferença estatística.

As semelhanças de resultados obtidos entre FDM1,0 e F1 podem ser explicadas pelo fato de que se tratam do mesmo polissacarídeo sulfatado, o qual é corroborado pelos espectros de infravermelho.

Um polissacarídeo extraído de Ascophilum nodosum também foi testado sobre as células B16-F10 em concentrações que variaram na faixa de 0 a 1000 μg durante 24h, diferentemente deste estudo, nenhuma das concentrações apresentou inibição da viabilidade celular (ABU, 2015).

Figura 15. Efeito de FDM1,0 e F1 sobre a redução de MTT a cristais de formazan em

células de melanoma de camundongo (B16-F10). A. Tratamento de 24 horas. B. Tratamento de 48h. a, b, c_{: letras diferentes indicam que há diferença estatística entre}

as concentrações da mesma amostra (p<0,05). * indica que há diferença significativa entre as amostras quando testada a mesma massa (p<0,05). Valores são médias percentuais ± desvio padrão (n=3).

Células de adenocarcinoma renal humano (786-O) também foram submetidas aos efeitos dos PS de D. menstrualis. Nos tratamentos de 24 e 48h, quando comparada a mesma massa aplicada das frações diferentes, todas apresentaram diferença estatística, exceto 100 µg em 48h (figura 16A e B). Ambos PS apresentaram efeito massa dependente, a partir de 40 µg, no tratamento de 24h e apenas F1 em 48h. No tratamento de 24h, tanto FDM1,0 quanto F1 exibiram elevado efeito sobre as células 786-O a partir de 60 µg.

A comparação dos resultados, no tratamento de 24h, entre os PS mostra que purificar FDM1,0 não promoveu a potencialização da sua atividade inibitória sobre as células 786-O. Apenas no tratamento de 48h, F1 expressou resultados mais altos. Provavelmente, a atividade observada em FDM1,0 deve-se à sinergia dos PS de diferentes massas moleculares. Contudo, é notório o intenso efeito inibitório de ambos os PS, quando aplicada a massa de 100 µg nos tratamentos de 24 e 48h, o qual corresponde a 100% de inibição da atividade células da linhagem 786-O.

Amorim et al (2016) avaliaram o efeito da fucana A da alga Spatoglossum schröederi sobre células 786-O e não observaram efeito sobre a redução de MTT, entretanto, ao incorporá-la na síntese de nanopartículas de prata o efeito do metal de transição foi potencializado pelo polissacarídeo, chegando a 80% de inibição da redução do MTT, mesmo em concentrações muito baixas.

Segundo a literatura há um relação positiva entre fucanas com baixo peso molecular e sua atividade antiproliferativa (CHO et al, 2010; WU et al, 2016), contudo, uma grande parcela dos polissacarídeos sulfatados de D. menstrualis, aqui estudados, possuem mais de 100 kDa e apresentaram elevada atividade no ensaio de MTT. Devido a alta inibição das células 786-O submetidas à 100µg de FDM1,0 e F1, esta linhagem celular foi escolhida para realizar o ensaio de morte celular com anexina-V e iodeto de propídio.

Figura 16. Efeito de FDM1,0 e F1 sobre a redução de MTT a cristais de formazan em

células de adenocarcinoma renal humano (786-O). A. Tratamento de 24 horas. B. Tratamento de 48 horas. a,b,c,d,e,f,g,h_{: letras diferentes indicam que há diferença}

estatística entre as concentrações da mesma amostra (p<0,05). * indica que há diferença significativa entre as amostras quando testada a mesma massa (p<0,05). Valores são médias percentuais ± desvio padrão (n=3).

4.4.1.2. Efeito de FDM1,0 e F1 sobre a viabilidade celular da linhagem 786-O

Células de adenocarcinoma renal (786-O) foram avaliadas quanto à viabilidade sob o efeito das frações de D. menstrualis na concentração de 1 mg/ml. Esta concentração foi utilizada afim de manter a proporção entre a massa de amostra e o volume de meio, isto é, a massa de 100 µg utilizada no ensaio de MTT corresponde à concentração de 1 mg/ml. A anexina-V, utilizada neste teste, é uma proteína que se liga fortemente e especificamente a fosfatidilserina, porém, nas células em processo de apoptose e necrose, este fosfolipídio é deslocado da superfície interna da membrana plasmática para a externa, por esta razão, a marcação com anexina-V indica células não viáveis (Galluzzi et al, 2009; Kroemer et al, 2009). Quanto ao iodeto de propídio, se trata de um composto fluorescente que não tem a capacidade de penetrar células viáveis, ele o faz somente quando a integridade da membrana plasmática está comprometida, podendo se ligar ao DNA fragmentado, característica típica de células em necrose e também apoptose (LOO; RILLEMA, 1998; MOORE et al, 1998; RICCARDI; NICOLETTI, 2006).

Apesar da forte inibição das células 786-O no ensaio de redução de MTT, não foi observada diferença entre o controle e as células tratadas com FDM1,0 e F1 (figura 17). Isso pode ser devido à diferença de princípio dos métodos, o ensaio de MTT avalia a capacidade que um composto tem de influenciar a atividade enzimática de desidrogenases mitocondriais, enquanto que o ensaio de morte celular por marcação com anexina-V e PI se baseia na marcação de fosfolipídios que só são expostos em condições de morte celular e moléculas que só podem ser acessadas com o comprometimento da membrana plasmática, respectivamente. O que indica que outros ensaios são necessários para elucidar o mecanismo de ação de FDM1,0 e F1 sobre as células 786-O.

Figura 17. Efeito de FDM1,0 e F1 sobre a viabilidade celular da linhagem 786-O. A.

Controle. B. Células submetidas a 1mg/ml de FDM1,0. C. Células submetidas a 1mg/ml de F1.

4.4.2. Atividade antioxidante