Efeito do controle de temperatura do biorreator

Na sequência, foram realizados ensaios em biorreator de tambor rotativo nos quais se procurou exercer um controle mais efetivo sobre a temperatura do meio de cultivo sólido. Esta avaliação foi feita em cultivos com volume de ocupação do biorreator de 30%, sem agitação, e 50%, com agitação, condições que, até este ponto do estudo, resultaram nas maiores atividades de pectinases totais (item 4.2.1.1). Para o controle da temperatura, foi utilizado um aspersor de água para resfriar a superfície externa do reator. A remoção de calor neste sistema foi realizada por condução, com as regiões quentes do meio de cultivo entrando em contato com a parede fria do biorreator.

Os perfis de variação de temperatura dos cultivos estático e agitado, realizados com 30 e 50% de ocupação do reator, com e sem controle de temperatura, são ilustrados na Figura 18. Como mostrado nesta figura, na ausência de controle de temperatura, este parâmetro supera os 45^oC, valor que poderia, em princípio, prejudicar o processo, tanto pelo fato de ser inadequado ao crescimento de A. niger, que se situa idealmente na faixa de 30 a 35^oC (Palacios-Cabrera et al., 2005; Gougouli & Koutsoumanis, 2010), quanto pela

sensível perda de atividade de pectinases observada nessa temperatura (Sandri, 2010). Segundo Mitchell et al. (2006), em cultivos em estado sólido, mesmo com o uso de fluxo de ar e camisa de resfriamento, a temperatura pode aumentar, em um período de poucas horas, de 10 a 20^oC acima da temperatura desejada. No entanto, o sistema de arrefecimento utilizado, apesar de sua simplicidade, reduziu significativamente a temperatura do meio em comparação com a condição sem controle, embora tenha ficado evidente a dificuldade em manter-se este parâmetro estável devido à grande quantidade de calor metabólico gerado durante o cultivo.

Figura 18 – Variação da temperatura do meio de cultivo de Aspergillus niger LB-02-SF

com o tempo em biorreator de tambor rotativo com volume de ocupação de 30% - estático (a) e 50% - agitado (b): cultivo com controle de temperatura (■); cultivo sem controle de temperatura (○).

Observou-se que para o menor volume de ocupação (30%), a temperatura, após subir até cerca de 35^oC em aproximadamente 48 horas, foi mais facilmente controlada na sequência do cultivo. Nesta condição, como era esperado, determinou-se um crescimento celular maior quando a temperatura do cultivo foi controlada (Tabela 6). Porém, a atividade pectinolítica total sofreu um decréscimo de mais de 50%, sendo reduzida de 170,8 U/g para 84,4 U/g nos ensaios sem e com controle de temperatura, respectivamente. Já no ensaio com 50% de ocupação e mantendo a agitação padrão do sistema, o perfil de concentração celular foi similar, porém a atividade de pectinases totais novamente foi reduziu de 178,2 para 46,4 U/g nos cultivos sem e com controle de temperatura, respectivamente. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 15 20 25 30 35 40 45 50 Te mperatura ( oC) Tempo (h) (b) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 15 20 25 30 35 40 45 50 Te mperatura ( o C) Tempo (h) (a)

Tabela 6 – Resultados gerais de cultivos de Aspergillus niger LB-02-SF em biorreator de

tambor rotativo com volume de ocupação do reator em 30% sem agitação e 50% com agitação, com e sem controle de temperatura.

Vol. ocup. 30% 50%

Controle Sem controle Controle Sem controle

X_max (mg/g) 196,2^a ± 1,8 147,9^b ± 9,8 181,2^a ± 2,0 173,0^a ± 5,4 t_{X,max (h)} 72 72 76 72 PT (U/g) 84,4^b ± 3,5 170,8^a ± 0,7 46,4^b ± 8,1 178,2^a ± 15,5 Umidade (%) 60^a ± 1,6 65,4^a ± 2,1 63,9^a ± 0,6 69,9^a ± 0,5 S0 (mg/g) 396 462 414 423 Scons (mg/g) 215 302 230 319 YP/X (U/mg) 0,43^b ± 0,00 1,15^a ± 0,06 0,25^b ± 0,04 1,06^a ± 0,12 YP/S (U/mg) 0,39^b ± 0,00 0,56^a ± 0,01 0,20^b ± 0,03 0,57^a ± 0,05 YX/S (mg/mg) 0,91^a ± 0,00 0,49^b ± 0,02 0,78^a ± 0,01 0,54^a ± 0,02

Vol. ocup. – volume de ocupação do reator; X_max – máxima concentração de biomassa; t_X,max – tempo em

que ocorreu X_max; PT – pectinases totais em 96 h; S₀ – Concentração inicial de açúcares redutores totais;

S_cons – açúcares redutores totais consumidos em 96 h; Y_P/X – fator de produção específica; YP/S – fator de

conversão de substrato em produto; YX/S – fator de conversão de substrato em células. Umidade inicial –

54%. Letras diferentes (a-b) indicam diferença significativa ao nível de 5% (p< 0,05) para ensaios em duplicata.

Os resultados obtidos nestes ensaios levantam a seguinte questão com respeito ao controle de temperatura: se o crescimento celular foi superior nesta condição, como no caso do ensaio não agitado com ocupação de 30%, ou se o crescimento foi similar, caso do cultivo agitado com ocupação de 50%, por que a atividade de pectinases foi significativamente inferior quando a temperatura foi controlada numa faixa mais favorável ao crescimento? Comportamento semelhante foi observado por Polidoro (2009), em cultivo de A. niger T0005/007-2 em tambor rotativo, tendo este autor sugerido que a produção de pectinases é favorecida quando o microrganismo se encontra sob efeito de estresse. Também em CES, Castro et al. (2015), verificaram que com a redução da atividade de água do meio, houve aumento na atividade de proteases. Os autores apontaram que a redução na atividade de água causou uma condição de estresse que levou a maior indução das enzimas. Para outro parâmetro essencial em bioprocessos, o pH, Malvessi & Silveira (2004), Fontana et al. (2009), Fontana & Silveira (2012) e Meneghel et al. (2014) também constataram que a produção de pectinases por A. oryzae em meio líquido foi praticamente nula em condição favorável ao crescimento (pH em torno de 4,0) e

intensificada quando o crescimento foi inviabilizado (pH em torno de 2,7). O conjunto destes trabalhos mostra, portanto, que a produção das pectinases se dá preferencialmente quando o microrganismo se encontra em ambiente inadequado ao crescimento. Ao analisar os resultados, seria possível se supor que a alta temperatura do meio tenha gerado uma condição de estresse – desfavorável ao crescimento – portanto levando a maior produção de enzimas.

Apesar do aumento da temperatura até 45^oC, não houve queda de atividade durante o processo de produção da enzima, como será observado posteriormente na Figura 19-b, demonstrando que a enzima produzida apresenta alguma estabilidade a essa temperatura. Mohsen et al. (2009) e Hendges et al. (2011) relataram que pectinases produzidas por diferentes linhagens de A. niger mostraram ser completamente estáveis a 30^oC; porém, as atividades foram reduzidas em aproximadamente 60% e 80%, respectivamente, quando expostas a 40^oC por 60 minutos. Considerando os resultados de estabilidade à temperatura realizados para o extrato produzido neste trabalho (dados mostrados no item 4.6.1) e os resultados de Hendges et al. (2011) e Sandri (2010), teoricamente entre 40 e 50^oC, a perda de atividade seria em torno de 35%. Esses dados indicam que a velocidade de produção das enzimas é maior que a velocidade de degradação durante o cultivo.

Os resultados destes ensaios mostraram, como descrito, que a natural elevação de temperatura durante o cultivo em meio sólido favorece a produção de pectinases por A. niger LB-02-SF. Esta constatação pode se considerada como uma vantagem para a condução da produção destas enzimas em CES, visto que a temperatura é um parâmetro de difícil controle nesta modalidade de bioprocesso.