Na ausência de LPS, a incubação de plaquetas com ECG (100 µM) não modificou a agregação induzida por ADP na ausência ou presença de linfócitos (figura 6A). Entretanto, o ECG reverteu o efeito inibitório dos linfócitos na agregação quando as plaquetas foram co-incubadas com LPS (figura 6B). Quando as plaquetas foram co-incubadas com ECG e LPS na ausência de linfócitos, uma pequena (mas significante) inibição da agregação plaquetária foi observada (figura 6B).
Figura 6. O 3-epigalocatequina galato (ECG) previne o efeito inibitório dos linfócitos
na agregação plaquetária na presença de LPS. Plaquetas de ratos (1,2 x 108
plaquetas/mL) foram incubadas com linfócitos (5 x 106 linfócitos/mL) por 6 h a
temperatura ambiente na ausência ou na presença de ECG (100 µM). Após a remoção dos linfócitos, as plaquetas foram ativadas com ADP (5 µM). Os experimentos foram realizados na ausência (A) ou na presença de LPS (100 µg/ml) (B). Os resultados estão representados como média ± EPM. **p<0,01 comparado aos respectivos
controles na ausência dos linfócitos. #p<0,05, ##p<0,01 comparado aos respectivos
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5 DISCUSSÃO
Neste estudo demonstramos que os linfócitos, em condições fisiológicas, inibem a agregação plaquetária através de mecanismos dependentes de NO e GMPc. No entanto, o efeito inibitório dos linfócitos na agregação plaquetária na presença de LPS é mediado por mecanismos independentes de GMPc e envolve a produção de peroxinitrito.
Os linfócitos ativados podem liberar diferentes substâncias, incluindo o NO (81, 82). O NO é sintetizado em linfócitos a partir de L-arginina pela óxido nítrico sintase (NOS), que consiste em três isoformas, a neuronal (nNOS), a induzível (iNOS) e a endotelial (eNOS) que são constitutivamente expressa nestas células (46).
Já está bem estabelecido que as plaquetas são inibidas pelo NO através de mecanismos dependentes e independentes de GMPc. O NO, em baixas concentrações na ordem de nanomolar, liga-se fortemente ao grupo protético da subunidade β da enzima guanilil ciclase, levando a sua ativação e subsequente conversão do GTP a GMPc (83). O aumento dos níveis do GMPc causa diferentes efeitos nas células, os quais são principalmente mediados pela ativação da quinase dependente de GMPc (PKG) (20). A PKG fosforila, diretamente, receptores de IP3 no
sistema tubular denso, desta forma contribuindo para a diminuição de Ca2+ intracelular
em plaquetas ativadas e também inibe a entrada deste íon nestas células (21, 84). Além disso, a ativação da via GMPc-PKG reduz a ativação plaquetária através da diminuição da ativação do receptor de fibrinogênio, integrina IIbβ3, e polimerização
da actina, através da fosforilação da VASP e proteína de choque térmico 27 (shock protein 27, HSP 27), respectivamente (23, 24).
No presente trabalho, a co-incubação de plaquetas e linfócitos por 6 h levou a uma inibição significativa da agregação a qual foi acompanhada por um aumento marcante dos níveis de GMPc nas plaquetas. Este efeito inibitório foi prevenido pela incubação dos linfócitos e plaquetas com L-NAME (inibidor não seletivo da NOS) ou com 1400W (inibidor seletivo da iNOS). Estes resultados indicam que o NO, mais provavelmente proveniente da iNOS dos linfócitos, é o mediador responsável pela inibição da agregação plaquetária. Nossos resultados mostraram que a incubação de plaquetas com linfócitos por 1 e 4 h não levou a inibição da agregação, reforçando o envolvimento da iNOS neste efeito, já que esta isoforma requer períodos de tempo maiores para ser expressa (85).
Ainda, nós utilizamos o inibidor da guanilil cilase solúvel (sGC) ODQ para investigar se os mecanismos envolvidos no efeito inibitório dos linfócitos na agregação eram dependentes de GMPc. O ODQ inibe a sGC através da oxidação do grupamento heme da enzima e, consequentemente, impedindo sua ligação ao NO (86). Desta forma, este composto vem sendo extensivamente utilizado para estudar as vias de sinalização mediadas por NO-GMPc. A co-incubação de linfócitos e plaquetas com o ODQ aboliu o aumento de GMPc em plaquetas e preveniu a inibição da agregação, indicando que o GMPc apresenta um papel fundamental neste efeito.
Apesar dos esforços da comunidade científica, a patofisiologia da sepse é ainda um sério problema na saude pública mudial e permanece pobremente compreendida. O LPS tem sido uma ferramenta muito útil para o estudo da sepse uma vez que pode mimetizar vários aspectos desta condição clínica. O LPS ativa diferentes células através da interação de múltiplas proteínas, envolvendo a proteína ligante de LPS (LBP), a CD14 e receptores TLR (toll-like receptor) (87).
Os efeitos do LPS em plaquetas são bastante conflitantes. Por exemplo, já foi mostrado que a incubação in vitro do LPS de E. coli com plaquetas inibe a agregação através da inibição da mobilização de Ca2+ e da ativação da proteína
quinase C (PKC) (65, 88). Por outro lado, também já foi demonstrado que a secreção e ativação plaquetária foi estimulada por LPS de E. coli (61). Enquanto que, outro estudo mostrou que o LPS de E. coli não afeta a agregação plaquetária, bem como a mobilização de Ca2+ ou a expressão de P-selectina nestas células (89).
Como mencionado na introdução, linfócitos e plaquetas parecem desempenhar um papel importante na sepse, sendo assim, decidimos estudar os efeitos dos linfócitos na agregação plaquetária na presença de LPS. Nossos resultados mostraram que a incubação por 6 h com LPS de E. coli não levou a ativação plaquetária ou inibiu a agregação induzida por ADP, indicando que, apesar da presença do TLR4 na superfície plaquetária, o LPS não modula a reatividade plaquetária in vitro.
Além do GMPc, o NO modula a atividade plaquetária através da formação de peroxinitrito (ONOO-), o qual é produzido pela reação entre NO e O
2-. O LPS leva
a produção de espécies reativas de oxigênio em diferentes células, incluindo plaquetas (67) e linfócitos (79). Em nosso estudo, a co-incubação de linfócitos e plaquetas na presença de LPS por 6 h produziu uma significante inibição da agregação induzida por ADP, sendo este efeito também acompanhado por aumento
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significativo dos níveis de GMPc intraplaquetário. Da mesma forma que o observado na ausência do LPS, o tratamento da suspensão celular com o L-NAME ou 1400W preveniu o efeito inibitório dos linfócitos na agregação na presença do LPS. Entretanto, apesar do ODQ ter reduzido os níveis de GMPc intraplaquetáro, a inibição da sGC não afetou o efeito inibitório dos linfócitos na agregação na presenção do LPS. Por outro lado, na presença de LPS, o sequestrador de ONOO- ECG aboliu
o efeito inibitório dos linfócitos na agregação, indicando que nesta condição a inibição da agregação se dá por mecanismos independentes de GMPc. Reforçando estes resultados, foi observado que na ausência de LPS, o ECG não afetou o efeito inibitório dos linfócitos na agregação.
O ONOO-, na presença de plasma, sempre inibe as plaquetas,
provavelmente devido a sua conversão a NO ou doadores de NO (33). Até o momento, trabalhos têm mostrado que o ONOO- pode modular a atividade plaquetária
dependendo da sua concentração. Altas concentrações de ONOO- ativam plaquetas
levando a agregação, bem como aumento da expressão da P-selectina e da concentração de Ca2+ intraplaquetário. Por outro lado, baixas concentrações de
ONOO- inibem a atividade plaquetária (33). A agregação e secreção plaquetária
podem ser inibidas pelo ONOO- através da redução da produção de energia pelas
mitocôndrias (90). Além disso, o ONOO- também pode inibir a atividade plaquetária
através da inibição da síntese do prostanóide pró-agregante tromboxano A2 (TXA2) via nitração de resíduos de tirosina da cicloxigenase (34). Ainda, já foi descrito que a nitração da α-actinina tem um papel importante na inibição da agregação plaquetária pelo nitroprussiato de sódio (SNP) e pelo 3-morfolinosidnonimina (SIN-1), provavelmente via formação de ONOO- (11, 35).
Portanto, no presente trabalho demonstramos que linfócitos modulam a reatividade plaquetária através da síntese de NO. O NO produzido por linfócitos pode atravessar a membrana plaquetária, ativar a sGC, levando a um aumento dos níveis de GMPc e inibição da agregação plaquetária. Entretanto, na presença de LPS, o NO produzido em altos níveis por linfócitos, pode reagir com o O2- levando a formação de
ONOO-,o qual leva a inibição plaquetária por mecanismos independentes de GMPc.
Desta forma, uma vez que um crescente número de trabalhos enfatiza o papel importante de plaquetas e linfócitos na sepse, este trabalho colabora para um melhor entendimento desta condição.
Em nosso trabalho, nós demonstramos que os linfócitos são capazes de inibir a agregação plaquetária principalmente através de mecanismos NO-GMPc- dependente, no entanto, os mecanismos independentes de GMPc, podem elevar a produção de peroxinitrito, o que explicaria a inibição da agregação plaquetaria causada por linfócitos na presença de LPS.
Os linfócitos ativados podem liberar diferentes substâncias, incluindo o NO (81, 82). O NO é sintetizado em linfócitos a partir de L-arginina pela óxido nítrico sintase (NOS), que consiste nas três isoformas, neuronal (nNOS), induzível (iNOS) e endotelial (eNOS) que são constitutivamente expressa nestas células (46). Em nossos experimentos, podemos demonstrar a inibição da agregação plaquetária pelos linfócitos após sua incubação com as plaquetas durante 6 h. O efeito inibitório dos linfócitos sobre a agregação plaquetária foi significativamente reduzida em ambos os grupos em que utilizamos o inibidor da NOS o L-NAME e pelo inibidor seletivo da iNOS, o 1400W, indicando que esse efeito é mediado por NO sintetizado especialmente pela iNOS.
Está bem estabelecido que a agregação plaquetaria é inibida pelo NO por meio de mecanismos de GMPc-dependentes e independentes (11). O NO em níveis nanomolares se liga fortemente a um grupo heme prostético na β-subunidade de guanilil-ciclase solúvel (sGC) e provoca a sua ativação (91, 92). A ativação da GCs aumenta a conversão de GTP em GMPc. Um aumento nos níveis de GMPc causa efeitos diferentes na célula que são em grande parte mediada através da ativação de quinases dependentes de cGMP (PKG isoenzimas de proteína) (23). Existem duas formas principais de PKG em mamíferos, PKG I e II PKG, mas em plaquetas somente a isoforma I é expressa (93). A maioria dos agonistas plaquetários ativam a PLC aumentando os níveis de Ca2+ citosólico de uma libertação dependente de Ca2 + de
IP3 a partir de armazenamentos intracelulares, assim como a estimulação da entrada de Ca2+ extracelular. PKG fosforila diretamente receptores de IP3 no sistema tubular
denso que contribuem para diminuir o nível de cálcio intracelular em plaquetas estimuladas, assim como inibindo a passagem de cálcio (21, 22). Além disso, PKG inibe a ativação das plaquetas através da redução da ativação do receptor de fibrinogénio e αIIbβ3 polimerização de actina através da proteína de choque térmico e VASP 27 (HSP 27) fosforilação, respectivamente(23).
O efeito inibitório sobre a agregação de linfócitos foi acompanhado por um aumento significativo nos níveis de GMPc em plaquetas. Utilizamos ODQ para
36
explorar os mecanismos dependentes de cGMP que medeiam o efeito inibitório de linfócitos na agregação de plaquetas. O ODQ inibe a atividade da guanilil-ciclase solúvel estimulada por NO, e tem sido amplamente utilizado para estudar a função da via de transdução de NO-cGMP. Este efeito inibidor de ODQ é devido a alterações no estado de oxidação da porção heme da guanilato ciclase, sem efeitos adversos na atividade catalítica da enzima (86). Na concentração utilizada no presente estudo, o ODQ aboliu a atividade dos linfócitos induzida por elevação de cGMP e evitou o efeito inibitório sobre a agregação de plaquetas, o que reforça o papel que o GMPc desempenha um papel importante mediar este fenómeno.
6 CONCLUSÃO
- Linfócitos inibem a agregação plaquetária induzida por ADP via formação de óxido nítrico proveniente, principalmente, da óxido nítrico sintase induzível;
- O efeito inibitório dos linfócitos na agregação é via sinalização mediada pelo GMPc;
- Linfócitos, na presença de LPS, modulam negativamente a agregação plaquetária por mecanismos envolvendo a formação de peroxinitrito.
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