4 Material e método
5.5 Efeito dos fatores de crescimento na síntese de TGF β e b-FGF
Os resultados do teste ELISA indicaram que, somente o tratamento com a associação de 1ng de cada fator de crescimento, estimulou a células a sintetizarem o TGF-β na concentração de 335,16 ± 101,65 pg/mL. Nos demais grupos, não foram detectada a presença deste fator de crescimento no sobrenadante.
Quanto a síntese de bFGF, este fator de crescimento foi encontrado no sobrenadante de todos os grupos (Tabela 3a – Anexos) (Gráfico 11), e o teste ANOVA mostrou haver diferenças entre os grupos (p<0.05). Para verificar qual tratamento estimulou mais as células do ligamento periodontal a sintetizarem o bFGF, o teste de Comparação Múltipla de Bonferroni foi empregado.
Os resultados indicaram que as células incubadas na presença de 10ng de bFGF apresentaram uma maior síntese deste fator de crescimento comparadas ao grupo controle (p<0.001), e a grupo TGF-β (p<0.001) (Tabela 8a - Anexos). Além disso, o tratamento com o bFGF modulou a síntese dele mesmo de maneira dose-dependente, já que houve uma diferença estatisticamente significante entre as doses de 10ng e 1ng de bFGF (p<0.05).
Quando os fatores de crescimento foram associados, a maiores concentrações de bFGF foram encontradas nos sobrenadantes das células tratadas com as associações que continham 10ng de bFGF (Gráfico 11). Porém, a maior dose de bFGF associada a menor dose de TGF-β promoveu uma maior síntese (p<0.001) comparada a associação das maiores doses de cada fator (Tabela 8a - Anexos).
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GRÁFICO 11 – bFGF presente no sobrenadante segundo o tratamento realizado.
Colunas indicam a síntese média em pg/mL, e as barras verticais o desvio padrão (experimento realizado em triplicata).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 cont role 1ng bFG F 1ng TG F 10n g bF GF 10ng TG F 1ng bFG F + 1 ng TGF 10ng bFG F + 10ng TG F 1ng bFG F + 10 ng TG F 10ng bFG F + 1ng TG F pg/mL
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6 Discussão
Atualmente, acredita-se que as células do ligamento periodontal são fundamentais para a regeneração dos tecidos periodontais perdidos em decorrência da progressão da doença periodontal destrutiva, sendo necessária a sua migração, inserção e proliferação sobre a superfície radicular, visando a síntese de componentes do tecido conjuntivo e a diferenciação em outros tipos celulares como os osteoblastos e cementoblastos.
Associado a esse conceito considera-se também que, existem certos mediadores químicos, como os fatores de crescimento, envolvidos com a coordenação de todos os eventos celulares, sendo o fator de crescimento de fibroblasto básico e o fator de transformação de crescimento beta, alguns dos mediadores que podem ter importante participação no processo de regeneração periodontal.
De fato, alguns estudos in vitro mostraram a capacidade de ambos os
fatores de crescimento em estimular a proliferação (TERRANOVA et al.57, 1989;
OATES et al.32,1993; DENNISON et al.9, 1994; TAKAYAMA et al.52,53, 1997, 1998;
MURAKAMI et al.28,29, 1999, 2003; SHIMAZU et al.46,45, 1999, 2003) e a síntese de
componentes da matriz extracelular (IGNOTZ e MASSAGUE17, 1986; IGNOTZ et
al.18, 1987; ALVARES et al.1, 1995; CHANG et al.6, 2002; MAILHOT et al.24, 1995;
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2001; SHIMAZU et al.45, 2003) enquanto que, alguns estudos realizados em cães,
vêm confirmar o efeito clínico representado pela maior regeneração de osso alveolar
com o TGF-β (MOHAMMED et al.27, 1998; WIKESJO et al.59, 1998), e de
ligamento periodontal, osso alveolar e cemento radicular com o bFGF (MURAKAMI et al.28,29, 1999, 2003; ROSSA Jr et al.41, 2000; TAKAYAMA et al.51, 2001).
Entretanto, até o momento, não se sabe como as células do ligamento periodontal responderiam à associação do bFGF ao TGF-β. Por esse motivo, o presente estudo empregou algumas metodologias com o objetivo de avaliar as reações das células do ligamento periodontal de humanos nas primeiras horas após a adição destes fatores de crescimento associados. Além disso, duas concentrações dos fatores de crescimento foram estudadas, visando a melhor compreensão do efeito dose versus atividades celulares.
Em relação à proliferação, quando os fatores de crescimento foram adicionados isoladamente ao meio de cultura, era esperado um aumento na resposta celular de maneira dose-dependente para o bFGF e TGF-β, e tempo-dependente somente para o TGF-β. No entanto, ambas as doses de bFGF não aumentaram a proliferação celular em nenhum dos períodos de incubação. Entretanto, apesar da grande variabilidade dos resultados encontrados na literatura, em geral, a dose de
10ng de bFGF tem exercido maior efeito mitogênico (TAKAYAMA et al.52,53, 1997,
1998; MURAKAMI et al.28, 1999; SHIMAZU et al.45, 2003). Quanto ao efeito tempo
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resposta mitogênica tal como observado neste estudo, já que na literatura, todos os trabalhos estudaram o efeito do bFGF em um único período.
O fator de transformação de crescimento beta tanto na concentração de 1ng como de 10ng em ambos períodos estimulou a proliferação celular. Esse
resultado concorda em parte com estudo de Oates et al.32 (1993), na qual as células do
ligamento periodontal de humanos proliferaram mais quando incubadas com 1ng de TGF-β, sendo que essa proliferação somente ocorreu após 48 horas.
Alguns fatores podem ter contribuído para as diferenças entre os resultados do presente estudo e dos dados encontrados na literatura. O primeiro a ser considerado, é o método empregado para avaliar a proliferação celular. No presente estudo, foi utilizado um método na qual, a transformação de MTS em formazan pelas células viáveis, produzia uma reação de coloração registrada como absorbância. Então, quanto maior o nível de absorbância, pressupõe-se a presença de um maior número de células. Por outro lado, os demais estudos, utilizaram a incorporação de substância radiotiva no DNA celular. Esse segundo método garante uma maior precisão dos resultados, ao passo que, a variação na intensidade da coloração é mais sensível, podendo ocasionar uma maior discrepância dos resultados entre as amostras do mesmo grupo.
O segundo fator está relacionado às características inerentes às linhagens celulares empregadas em cada estudo. Embora o presente estudo tenha utilizado cultura primária de células do ligamento periodontal obtidas a partir de pré-
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molares indicados para exodontia por razões ortodônticas, tal como, na metodologia
dos estudos disponíveis na literatura (TAKAYAMA et al.52,53, 1997, 1998; OATES et
al.32, 1993; DENNISON et al.9, 1994; MURAKAMI et al.28, 1999; SHIMAZU et
al.45, 2003), diferenças relacionadas aos próprios doadores como, variações
genotípicas, envolvimento sistêmico e idade, e as relacionadas às próprias células como, o grau de diferenciação celular, ou seja, o número de passagens (cultivos) a partir da cultura inicial as quais as células foram submetidas até o seu uso, podem influenciar na capacidade e/ou na quantidade de receptores para o bFGF e TGF-β expressos pelas células, e conseqüentemente, na resposta celular as estas substâncias.
Embora não tenha sido pesquisada a expressão de receptores para bFGF e TGF-β, acredita-se que, a diferença entre as passagens celulares utilizadas no
presente estudo (7ª - 10ª) e nos demais (3a a 5ª) não tenha influenciado em relação ao
número de receptores pelo menos, para o bFGF. Isto porque, o trabalho de Shimazu et
al.46 (1999), mostrou que as células do ligamento periodontal de humanos, não
apresentam diferenças quanto ao número de receptores FGFR1 e FGFR2 entre a 3ª e 10ª passagens. Além disso, é possível acreditar também, que o grau de diferenciação celular não tenha reduzido o número de receptores para o TGF-β, pois Somerman et
al.50 (1990) mostraram que, dentro de uma mesma linhagem, as células do ligamento
periodontal não sofrem alterações fenotípicas da 1ª até a 10ª passagem.
Mas as diferenças quanto aos tipos e quantidade de receptores expressos, pode estar relacionada à própria expressão fenotípica de cada linhagem
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estabelecida, já que existem diferentes subpopulações de células do ligamento
periodontal como identificado por Murakami et al.29 (2003) em humanos, e por Gao
et al.13 (1998), em ratos. No presente estudo, como o bFGF e o TGF-β utilizados
isoladamente, mostraram-se capazes de influenciar na expressão de genes para colágeno, TIMPs e metaloproteases, acredita-se que estas células do ligamento periodontal apresentem receptores para ambos os fatores de crescimento.
Entretanto, diante da metodologia empregada, não é possível determinar quais e quantos receptores estas expressaram. Pode-se supor que as células expressavam um grande número de receptores para bFGF e menor, para o TGF-β de tal maneira, que a maior dose de bFGF (10ng) não tenha sido suficiente para estimular ao máximo a proliferação celular enquanto que, a dose de 1ng de TGF- β já foi o suficiente para estimular a mitose celular. Ou então, que o número de receptores para o bFGF sejam tão baixos, que esse fator de crescimento até na menor concentração não foi capaz de exercer o seu efeito mitogênico.
Porém, quando ambos fatores de crescimento foram adicionados ao meio de cultura principalmente, a maior dose de bFGF associada a menor TGF-β, a proliferação celular foi superior ao grupo controle e ao uso isolado de ambos fatores, para os períodos de 24 e 48 horas. Essa mesma associação estimulou as células a sintetizarem uma maior quantidade de bFGF comparada aos demais grupos. Então, esse concentração de bFGF recém sintetizado pode ter sido necessária para este fator de crescimento unir-se aos receptores livres e estimular a proliferação celular, caso a
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suposição de que as células apresentem muitos receptores seja válida. Por outro lado, essa associação pode ter estimulado também, a expressão de receptores para o bFGF, aumentando o campo de atuação deste fator.
Diante desta observação, pode-se acreditar que o TGF-β por algum mecanismo desconhecido, atuou na modulação da síntese de bFGF pelas células do ligamento periodontal de humanos, e que essa modulação somente foi expressiva, quando os fatores de crescimento estavam associados (exceto para a associação das menores doses), já que o TGF-β isoladamente, não foi capaz de aumentar a síntese de bFGF comparado ao grupo controle.
No entanto, para verificar se o TGF-β realmente modula a síntese e até mesmo, a ação do bFGF, as células primeiramente deveriam que ter sido incubadas somente com o TGF-β, e posteriormente, o meio de cultura substituído por outro
contendo somente o bFGF, semelhante ao estudo de Oates et al.32 (1993), na qual os
autores avaliaram o efeito do TGF-β sobre o PDGF. Todavia, essa metodologia não simularia uma situação clínica, já que ao tratar uma lesão periodontal, os dois fatores de crescimento têm que ser aplicados ao mesmo tempo como realizado no estudo atual.
Por outro lado, ao mesmo tempo que, a dose de 1ng de TGF-β associada a 10ng de bFGF foi capaz de estimular a síntese de bFGF e potencializar a o estímulo a proliferação celular, esta concentração de TGF-β não conseguiu anular o efeito primariamente catabólico do bFGF na síntese de componentes da matriz
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extracelular. Esse efeito catabólico foi representado pelo aumentou na expressão de genes para as MMP-1 e MMP-2, e inibiu a expressão para os TIMPs e para os colágenos tipos I e III, resultado semelhante ao produzido pelo bFGF quando empregado isoladamente. Isso pode ter ocorrido pelo fato desta associação ter aumentando a síntese de bFGF, ou até mesmo, pelo aumento na expressão de receptores FGFR1 e/ou FGFR2, favorecendo a ação do bFGF sobre as células do ligamento periodontal.
Esse efeito proteolítico do bFGF pode ser necessário na fase inicial da cicatrização periodontal. Neste momento, há necessidade de aumento das colagenases para que estas possam promover a remoção dos fragmentos de colágeno e outros componentes da matriz extracelular degradados no processo patogênico, antes que os fibroblastos e demais células, iniciem a deposição de colágenos, fibronectina,
proteoglicanos, e outros componentes da matriz extracelular (WIKESJO et al.58,
1992). Como exemplo, o aumento na expressão da MMP-2, promovida por esse fator, pode ser de extrema importância, já que esta metaloprotease está relacionada à remoção de colágeno tipo I que apresentam estrutura anormal, os quais estariam retardando a formação de fibrilas colágenas durante a deposição e maturação das
matrizes teciduais (OVERALL et al.34, 1991).
Nas fases mais avançadas da cicatrização das lesões periodontais, onde há necessidade de formação tecidual, esse efeito catabólico do bFGF tem que ser “substituído” pelo efeito anabólico do TGF-β. Isso pode ocorrer naturalmente
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através da própria redução de expressão de receptores FGFR1 e FGFR2 pelas células
do ligamento periodontal (TAKAYAMA et al.53, 1998), ou então, pela associação de
uma concentração de TGF-β que seja capaz de anular ou modular o efeito proteolítico do bFGF.
De fato, essa segunda suposição é possível, já que todas a associações destes fatores de crescimento exceto, 10ng de bFGF com 1ng de TGF-β, atuaram na inibição da transcrição de genes para as MMP-1 e –2, aumentando a expressão colágeno tipos I e III, e TIMPs 1, 2 e 3, semelhante ao observado quando as células foram incubadas somente na presença do TGF-β.
A “anulação” ou “compensação” do efeito proteolítico do bFGF pelo TGF-β pode ter sido alcançado, por meio de vários mecanismos. A primeira possibilidade seria o fato de bFGF aumentar a síntese de TGF-β como observado por
Noda e Vogel31 (1989), o que levaria a uma sobreposição dos efeitos deste fator de
crescimento. No entanto, no sobrenadante celular, somente foi detectada a presença de TGF-β quando, associou-se as menores doses de cada fator. Então, de acordo com esses resultados é possível acreditar, que a síntese de TGF-β por esta linhagem utilizada, somente ocorra na presença de ambos, bFGF eTGF-β, e que essa associação tenha um efeito dose-dependente.
Por outro lado, os fatores de crescimento podem estar atuando de maneira independente nas atividades celulares, ou seja, o bFGF aumenta a expressão dos genes proteolíticos, mas isso é compensado pelo efeito formativo do TGF-β.
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Realmente, Edwards et al.10 (1987) verificaram em fibroblastos humanos do trato
respiratório inferior, que o TGF-β tem a capacidade de atenuar a expressão de mRNA para procolagenase aumentada pelo bFGF.
Um outro mecanismo pelo qual o TGF-β estaria modulando a resposta celular ao bFGF, seria através da sinalização intracelular. Apesar do bFGF e do TGF- β terem receptores específicos na membrana celular, após a união deste fatores de crescimento aos seus receptores, as vias pelas quais ambas substâncias irão sinalizar a transcrição dos diferentes genes por via autócrina podem ser semelhantes.
Embora já tenha sido demonstrado que a sinalização do TGF-β ocorra por meio da fosforilação dos receptores tipos I e II serina/teonina kinase e participação de Smads, existe a possibilidade deste fator de crescimento promover a
sinalização intra-celular através do padrão ERK/MAP kinase (SHI e MASSAGUE44,
2003). Esta constitui a principal via de sinalização utilizada pelo bFGF nas células do
ligamento periodontal de humanos (SHIMAZU et al.45, 2003).
É importante considerar que no presente estudo a inibição da transcrição de mRNA para os TIMPs não resultou num aumento expressivo para as
metaloproteases como observado por Overall et al.33 (1991). Principalmente, em
relação à concentração de 1ng de TGF-β, a qual inibição da expressão dos TIMPs- 2 e 3 foi acompanhada pela redução do genes para as MMPs-1 e –2.
Contudo, vale ressaltar que a expressão de genes para uma determinada proteína não significa que a célula irá sintetizá-la. Para ter a total certeza
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de que as células ao serem estimuladas pelo bFGF iriam realmente aumentar a síntese de metaloproteases e inibir de colágeno e dos TIMPs, seria necessário realizar o teste ELISA para detecção de todas essas proteínas no sobrenadante celular. Além disso, as metaloproteases, quando sintetizadas, são liberadas para a matriz extracelular na forma latente, e somente irão atuar quando receberem algum estímulo que permita a sua ativação. Ademais, a inibição das MMPs pelos TIMPs é um fenômeno que ocorre após ambas as proteínas terem sido sintetizadas, então o TGF-beta pode ter o efeito de reduzir a expressão de ambos, MMPs e TIMPs, ainda a nível de RNAm, antes, portanto, da proteína estar presente e disponível para exercer seus efeitos biológicos. Desta forma, a inibição das MMPs pelo TGF-beta ocorreria a nível transcricional e não indiretamente, via aumento na expressão dos TIMPs.
Portanto, para considerar o bFGF como um mediador químico de ação proteolítica, seria necessário uma complementação na metodologia do estudo, o que ajudaria também, na melhor compreensão dos reais efeitos deste e de outros fatores de crescimento. Além disso, seria interessante e necessário avaliar uma das principais atividades do bFGF, a sua capacidade de estimular a angiogênese, a qual não foi verificada neste trabalho. Uma vez que, a angiogênese é fundamental no processo regenerativo e, atualmente, desconhece-se o papel dos fibroblastos do ligamento periodontal neste fenômeno.
Ademais, os resultados obtidos em relação à associação do bFGF com o TGF-β não podem ser considerados conclusivos, já que na literatura, não há estudos
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que avaliaram in vitro essa associação na modulação das atividades das células do ligamento periodontal. Entretanto, dentro das limitações do estudo, podemos afirmar que há possibilidades na utilização do bFGF associado ao TGF-β na terapia regenerativa do periodonto, já que esses influenciaram positivamente a proliferação e a expressão de genes de componentes da matriz extracelular pelas células do ligamento periodontal de humanos. Além disso, pelos resultados parece que a
aplicação seqüencial, ou seja, a liberação destes fatores de crescimento de forma
sucessiva por dispositivos de liberação controlada, pode ser mais vantajosa do que a aplicação simultânea, uma vez que, neste último caso, os efeitos de um fator de crescimento podem antagonizar com os do outro.
Desta maneira, parece que mais estudos in vitro e in vivo aplicando o bFGF e o TGF-β associados a outros moduladores da resposta biológica, como o EGF, PDGF, IGF e as BMPs são fundamentais para estabelecermos o real papel de cada um no processo da regeneração periodontal.
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7 Conclusão
De acordo com a metodologia e os resultados encontrados pode-se concluir que:
1) Somente o TGF-β aplicado isoladamente apresentou efeito
mitogênico sobre as células do ligamento periodontal independente do período de avaliação. O bFGF somente estimulou a proliferação celular quando associado ao TGF-β;
2) TGF-β e bFGF exerceram efeitos antagônicos na expressão dos
genes avaliados. O TGF-β proporcionou um aumento na expressão de genes para colágeno tipo I e III, TIMPs 1, 2 e 3, e inibiram a expressão para MMP-1 e MMP-2 enquanto que, o bFGF apresentou efeito inverso.
3) O uso associado de 10ng de bFGF com 1ng de TGF-β apresentou efeito catabólico semelhante ao uso isolado do bFGF;
4) Em relação ao estímulo autócrino para síntese de bFGF e TGF-β,
todas as associação de ambos os fatores de crescimento e o uso isolado do bFGF estimularam as células do ligamento periodontal a sintetizarem o bFGF. No entanto, somente a associação das menores doses de cada fator de crescimento foi capaz de estimular a síntese de TGF-β.
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8 Anexos
Tabela 1a – Médias e desvio-padrão das absorbâncias segundo
tratamento realizado (n=3). GRUPOS Média ± s.d. 24horas
Média ± s.d. 48horas Controle (-)0,0026 ± 0,02 0,143 ± 0,041 1ng bFGF 0,051 ± 0,032 0,087 ± 0,018 1ngTGF 0,116 ± 0,041 0,129 ± 0,004 10ng bFGF 0,107 ± 0,012 0,119 ± 0,032 10ng TGF 0,146 ± 0,037 0,199 ± 0,027 1bFGF + 1ng TGF 0,127 ± 0,008 0,268 ± 0,039 10bFGF + 10ng TGF 0,225 ± 0,037 0,291 ± 0,018 1bFGF + 10ng TGF 0,215 ± 0,010 0,332 ± 0,006 10bFGF + 1ng TGF 0,285 ± 0,042 0,341 ± 0,056
Tabela 2a – Expressão relativa dos genes ColI, Col III, MMP-1, MMP-2, TIMP-1 e TIMP-3
em relação à expressão de beta-actina, segundo tratamento realizado (n=3).
GENES
TRATAMENTO COL I COL III MMP-1 MMP-2 TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TGF 1ng 6,96 ± 0,98 2,76 ± 0,49 (-)2,07 ±0,60 (-)2,44 ±0,28 4,97 ± 0,86 2,70 ± 0,88 7,91 ± 3,98 TGF 10ng 13,99 ± 2,94 10,80 ± 5,50 (-)4,40 ±1,66 (-)8,89 ±1,64 0,94 ± 1,00 (-)0,15 ±0,90 (-)0,36 ±0,60 b-FGF 1ng (-)1,14 ±0,22 (-)1,40 ±0,35 1,84 ± 0,77 7,62 ± 9,28 (-)0,33 ±1,16 (-)1,20 ±0,19 (-)1,61 ±0,51 b-FGF 10ng (-)1,67 ±0,65 (-)1,14 ±0,22 3,12 ± 0,71 2,42 ± 1,80 (-)3,90 ±3,32 (-)1,45 ±2,43 (-)2,90 ±2,45 1TGF + 1bFGF 5,51 ± 4,01 3,26 ±1,78 (-)0,47 ±1,87 (-)1,90 ±0,57 3,10 ± 1,48 1,67 ± 0,36 1,33 ± 0,13 10 TGF+10bFGF 3,09 ± 1,32 4,35 ± 2,22 (-)1,50 ±3,30 (-)6,70 ±0,98 3,84 ± 0,63 2,70 ± 0,46 2,70 ± 0,45 1TGF + 10 bFGF (-)1,09 ±0,06 (-)0,72 ±1,55 0,55 ± 1,40 2,04 ± 0,96 (-)2,01 ±1,44 (-)2,74 ±2,74 (-)0,68 ±1,63 10 TGF + 1bFGF 9,77 ± 7,50 7,31 ± 5,04 (-)0,51 ±1,41 (-)1,41 ±0,14 2,00 ± 0,74 2,35 ± 1,05 2,23 ± 1,11
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Tabela 3a – Médias e desvio-padrão da
concentração de bFGF em pg/mL, segundo tratamento realizado (n=3). GRUPOS MÉDIA ± SD (pg/ml) Controle 6,08 ± 2,64 1ng Bfgf 9,80 ± 3,80 1ng TGF 1,97 ± 0,82 10ng bFGF 16,5 ± 2,66 10ng TGF 5,17 ± 1,09 1ng bFGF + 1ng TGF 5,63 ± 1,09 10ng bFGF + 10ng TGF 29,11 ± 0,46 1ng bFGF + 10ng TGF 21,57 ± 1,64 10ng bFGF + 1ng TGF 36,39 ± 0,29
Tabela 4a – Comparação das médias de absorbância entre os períodos de 24 e 48
horas, usando o teste de Comparação Múltipla de Bonferroni.
Grupos Experimentais – Comparações Diferença média t p IC 95% da diferença Controle vs Controle 0,1457 5,798 P < 0.001 0.07155 to 0.2198 1bFGF vs 1Bfgf 0,03633 1,446 P > 0.05 -0.03779 to 0.1105 1TGF vs 1TGF 0,013 0,5174 P > 0.05 -0.06112 to 0.08712 10bFGF vs 10bFGF 0,1083 4,312 P < 0.01 0.03421 to 0.1825 10 TGF vs 10TGF 0,053 2,109 P > 0.05 -0.02112 to 0.1271 1bFGF+ 1TGF vs 1bFGF+1TGF 0,141 5,612 P < 0.001 0.06688 to 0.2151 10bFGF+ 10TGF vs 10bFGF+10TGF 0,067 2,667 P > 0.05 -0.007121 to 0.1411 1bFGF + 10TGF vs 1bFGF+10TGF 0,1173 4,67 P < 0.001 0.04321 to 0.1915 10 bFGF+ 1TGF vs 10bFGF+1TGF 0,05567 2,216 P > 0.05 -0.01845 to 0.1298
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Tabela 5a - Comparação das médias de absorbância entre os grupos celulares
cultivados 24h com o bFGF e/ou TGF-β, usando o teste de Comparação Múltipla de Bonferroni. Grupos Experimentais - Comparações Diferença média t p IC 95% da diferença controle x 1bFGF -0,05333 2,172 P > 0.05 -0.1460 to 0.03933 controle x 1TGF -0,1187 4,833 P < 0.01 -0.2113 to -0.02600 controle x 10 bFGF -0,01333 0,5431 P > 0.05 -0.1060 to 0.07933 controle x 10TGF -0,1487 6,055 P < 0.001 -0.2413 to -0.05600 controle x 1bFGF+ 1TGF -0,13 5,295 P < 0.01 -0.2227 to -0.03733 controle x 10bFGF+ 10TGF -0,2273 9,259 P < 0.001 -0.3200 to -0.1347 controle x 1bFGF+ 10TGF -0,2173 8,852 P < 0.001 -0.3100 to -0.1247 controle x 10bFGF+ 1TGF -0,288 11,73 P < 0.001 -0.3807 to -0.1953 1bFGF x 1TGF -0,06533 2,661 P > 0.05 -0.1580 to 0.02733 1bFGF x 10bFGF 0,04 1,629 P > 0.05 -0.05267 to 0.1327 1bFGF x 10TGF -0,09533 3,883 P < 0.05 -0.1880 to -0.002667 1bFGF x 1bFGF+ 1TGF -0,07667 3,123 P > 0.05 -0.1693 to 0.01600 1bFGF x 10bFGF+ 10TGF -0,174 7,087 P < 0.001 -0.2667 to -0.08133 1bFGF x 1bFGF+ 10TGF -0,164 6,68 P < 0.001 -0.2567 to -0.07133 1bFGF x 10bFGF+ 1TGF -0,2347 9,558 P < 0.001 -0.3273 to -0.1420 1TGF x 10bFGF 0,1053 4,29 P < 0.05 0.01267 to 0.1980 1TGF x 10TGF -0,03 1,222 P > 0.05 -0.1227 to 0.06267 1TGF x 1bFGF+ 1TGF -0,01133 0,4616 P > 0.05 -0.1040 to 0.08133