Efeito do L-NAME, INDO e TEA sobre o vasorrelaxamento induzido por ACh

Como observado na tabela 2, o L-NAME (100 µM) foi capaz de reduzir significativamente o vasorrelaxamento induzido por ACh em todos os grupos. Porém, o grupo diabético tratado somente com L-Arg (DL-Arg), esta redução (p < 0,001) foi muito mais pronunciada quando comparado com o DS (Fig. 8).

4 5 6 7 8 9 0 25 50 75 100 125 DS(Rmax= 101,5± 3,2%) DL-Arg(Rmax= 100,9± 4,0%) DT(Rmax= 101,7± 3,0%) DT+L-Arg(R_max= 108,9± 3,0%) - Log [ACh] M % d e r e la x a m e n to

Tabela 2- Valores de pD2 e Rmax obtidos de curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) em anéis isolados de artéria mesentérica superior de ratos com endotélio intacto pré-contraídas com FEN (10 µM) antes e após o pré-tratamento com L-NAME.

Os anéis isolados foram obtidos de ratos dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético + L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). Experimentos foram realizados na ausência de L-NAME (ACh) e na presença de 100 µM de L-NAME (L-NAME). Os dados representam as médias ± E.P.M. As diferenças estatísticas entre as médias foram determinadas pelo teste t de student pareado. *p < 0,05; **p < 0,01 e ***p < 0,001 para valores ACh vs L-NAME. ---: os pontos não convergiram sobre a curva.

Figura 8- Efeitos do L-NAME sobre as curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 - 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM) dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). Os dados representam as médias ± E.P.M. para 5 - 8 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas-vias seguido do pós-teste de Bonferroni.

Grupos Condição n pD2 Rmax (%)

DS ACh 7 6,8 ± 0,12 101,5 ± 3,2 L-NAME 7 6,0 ± 0,14*** 85,7 ± 4,9* DL-Arg ACh 7 6,2 ± 0,11 100,9 ± 4,0 L-NAME 7 --- -2,9 ± 4,1*** DT ACh 7 6,9 ± 0,09 101,7 ± 3,0 L-NAME 7 5,8 ± 0,20*** 75,3 ± 6,2** DT + L-Arg ACh 7 6,7 ± 0,09 108,9 ± 3,0 L-NAME 7 5,4 ± 0,14*** 69,2 ± 4,3*** 4 5 6 7 8 9 -25 0 25 50 75 100 DS(Rmax= 85,75± 4,9%) DL-Arg(Rmax= -2,9 ± 4,1%) DT(Rmax= 75,28± 6,2%) DT+L-Arg(Rmax= 69,20± 4,3%) *** *** *** ** ** - Log [ACh] M % d e r e la x a m e n to

Após a adição de L-NAME + INDO (10 µM) o grupo DL-Arg apresentou não somente um bloqueio, mas sim, uma reversão significativa (p < 0,01 e p < 0,001) dos vasorrelaxamentos induzidos por ACh quando comparado com o grupo DS (Fig. 9). Além disso, o grupo DT + L-Arg apresentou uma redução significativa (p < 0,001) apenas na última concentração quando comparado com o DS (Fig. 9).

Figura 9- Efeitos do L-NAME + INDO sobre as curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 - 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré- contraídas com FEN (10 µM) dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético L-arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). Os dados representam as médias ± E.P.M. para 5 - 8 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas-vias seguido do pós-teste de Bonferroni.

Já a presença de L-NAME + INDO + TEA (1 µM) (Fig. 10), o grupo DL-Arg apresentou na sua curva uma reversão significativa (p < 0,001) dos vasorrelaxamentos induzidos por ACh quando comparado com o grupo DS. Os grupos DT e DT + L-Arg apresentaram uma redução significativa (p < 0,001) somente nas duas últimas concentrações quando comparados com o grupo DS (Fig. 10). O EE não apresentou modificações em seu vasorrelaxamento quando comparado com o CON (Tabela 3).

4 5 6 7 8 9 -25 0 25 50 75 100 DS(R_max= 58,49± 11,68%) DT(Rmax= 52,13± 12,40%) DT+L-Arg(R_max= 6,0± 3,0%) *** DL-Arg(R_max= -21,4± 7,1%) *** ** * - Log [ACh] M % d e r e la x a m e n to

Figura 10- Efeitos do L-NAME + INDO + TEA sobre as curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 - 10-4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10 µM) dos grupos Diabético Sedentário (DS), Diabético L- arginina (DL-Arg), Diabético Treinado (DT) e Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg). Os dados representam as médias ± E.P.M. para 5 - 8 experimentos em cada grupo. As diferenças estatísticas foram determinadas pela ANOVA de duas-vias seguido do pós-teste de Bonferroni.

Tabela 3- Valores Rmax obtidos de curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10-4 M) construídas na condição controle ou na presença dos seguintes inibidores: L-NAME, L-NAME + INDO e L- NAME + INDO + TEA.

Os anéis isolados foram obtidos de ratos dos grupos Controle (CON) e Estimulado Eletricamente (EE). Experimentos foram realizados na presença de L-NAME (100 µM); na presença de L-NAME + INDO (10 µM) e na presença de L-NAME + INDO + TEA (1 µM). Os dados representam as médias ± E.P.M. As diferenças estatísticas entre as médias foram determinadas pelo teste t de student não pareado.

Condição CON (n = 7) EE (n = 7) ACh 114,2 ± 4,0 108,5 ± 4,3 L-NAME 16,7 ± 5,4 16,2 ± 5,1 L-NAME + INDO 0,5 ± 2,3 2,9 ± 4,2 L-NAME + INDO + TEA _{-1,5 ± 2,2 4,3 ± 3,0}

4 5 6 7 8 9 -25 0 25 50 75 100 DT(R_max= 0,5± 3,4%) *** *** DT+L-Arg(Rmax= -0,4± 2,3%) *** *** - Log [ACh] M % d e r e la x a m e n to

6 DISCUSSÃO

No presente estudo, os animais do grupo CT apresentaram uma melhora no condicionamento físico, demonstrando a eficiência do ER na condição saudável. Estes resultados estão de acordo com aqueles encontrados por Barauna e colaboradores (2005). De maneira semelhante, os nossos animais diabéticos tratados com L-Arg por 8 semanas também apresentaram uma melhora em seus níveis de força máxima. Estudos também demonstram que a administração da L-Arg pode influenciar no desempenho do teste de 1RM de indivíduos saudáveis (CAMPBELL et al., 2006).

Nossos resultados demonstram que 8 semanas de ER não foram capazes de prevenir a perda de peso corporal nos animais diabéticos. A falta de condicionamento físico nestes animais pode ter sido um dos fatores que contribuíram para a redução encontrada no peso corporal. Achados divergentes encontrados por Harthmann e colaboradores (2007) demonstraram que o exercício aeróbio (EA) foi capaz de aumentar o peso corporal dos animais diabéticos e este achado foi atribuído a uma melhora metabólica induzido pelo treinamento.

Interessantemente, os grupos tratados com L-Arg não apresentaram variações do peso corporal entre o início e o fim do estudo. A manutenção do peso corporal apresentada por estes animais pode ser atribuída a uma possível redução do estresse oxidativo ocasionada por este tratamento. Estudos clínicos e experimentais sugerem que o tratamento com L-Arg reduz a lipoperoxidação no DM (LUBEC et al., 1997a; LUBEC et al., 1997b)

Além da lipoperoxidação, o DM apresenta um quadro de degradação protéica (FAGAN et al., 1987; GARLICK et al., 1981). Desta forma, a L-Arg também pode ter contribuído para a manutenção do peso corporal devido a uma manutenção da síntese protéica. Uma vez que, evidências apontam que a L-Arg possui um importante papel na síntese protéica e na biosíntese de outros aminoácidos (MORRIS, 2006; WU et al., 2009). Apesar destes efeitos, o tratamento crônico por 12 semanas com a L-Arg não foi capaz de causar mudança significativa na insulina plasmática, colesterol, triglicerídeos e glicemia nos ratos diabéticos(ÖZÇELIKAY et al., 1999).

É importante ressaltar que os dados na literatura em relação aos benefícios metabólicos ER sobre a prevenção e o tratamento do DM1, ainda não são consistentes. Farrell colaboradores (1999) demonstram que o tratamento com ER ao final de 8 semanas reduz a glicemia de animais com DM1. Em nosso estudo, o ER não foi capaz de reduzir os níveis plasmáticos da glicemia, possivelmente porque os animais diabéticos treinados não conseguiram se condicionar com o protocolo de treinamento adotado. Interessantemente, quando o ER foi associado ao tratamento com L-Arg foi observado uma redução na glicemia acompanhada de uma melhora no condicionamento físico dos animais.

Pela primeira vez, foi demonstrado que o modelo de treinamento adotado no presente estudo pode ser usado para investigar os efeitos do ER sobre a reatividade vascular, uma vez que o grupo EE não apresentou alterações nos vasorrelaxamentos induzidos por ACh quando comparado com o grupo CON. Este resultado sugere que a eletroestimulação não foi capaz de proporcionar alterações na reatividade vascular em anéis isolados de artéria mesentérica superior de ratos. Os parâmetros de eletroestimulação utilizados no presente estudo foram adotados porque, segundo Barauna e colaboradores (2005), não foram observadas mudanças nos níveis plasmáticos das catecolaminas, da atividade simpática e da hipertrofia adrenal.

Apesar disto, o grupo CT apresentou uma redução nos vasorrelaxamentos induzido por ACh quando comparado com o grupo CON, mesmo sendo um dos grupos que apresentou uma melhora no condicionamento físico. Algumas evidências sugerem que o ER em pessoas saudáveis tem demonstrado induzir um aumento da rigidez arterial (HEFFEMAN et al., 2007; MIYACHI et al., 2004). No entanto, estes achados não têm sido consistentes. Rakobowchuk e colaboradores (2005) não observaram um aumento da rigidez na artéria carótida após 12 semanas de ER em indivíduos saudáveis.

Alguns estudos têm demonstrado que o DM promove alterações na vasodilatação dependente do endotélio induzidas por ACh em diferentes leitos vasculares (COSENTINO; LUSCHER, 1998; LASH; BOHLEN, 1991). Estas alterações parecem ser causadas tanto pela hiperglicemia, quanto pela duração do DM (SINGH et al., 2003). Nossos animais diabéticos sedentários apresentaram redução nos vasorrelaxamentos induzidos por ACh após 8 semanas de hiperglicemia

severa. Isto pode ser explicado porque, de acordo com a literatura a hiperglicemia inibe a eNOS, enzima catalisadora da síntese de NO (CAI; HARRISON, 2000).

Nossos resultados também demonstraram uma redução na sensibilidade arterial a ACh somente no grupo diabético tratado com L-Arg. Esta redução pode ter sido devido a uma menor participação na atividade dos receptores muscarínicos em detrimento de outros receptores responsáveis também em ativar o NO, como por exemplo, o NK1 e o B2, ativados pelos agonistas substância P e bradicinina respectivamente (FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2009; FURCHGOTT, 1983). Entretanto, outros experimentos são necessários para entender o efeito da redução na sensibilidade a ACh em artéria mesentérica de ratos diabéticos.

Sabe-se que os vasorrelaxamentos induzidos por ACh ativa as cascatas enzimáticas dos EDRFs, que são o NO, a prostaciclina (PGI2) e os fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio (EDHFs) (BUSSE et al., 2002; MAIORANA et al., 2003; YANG et al., 2003). A participação do NO em nosso estudo foi avaliada através das curvas concentração-resposta para ACh realizadas na presença de L-NAME. Nesta condição experimental, foi observado que o L-NAME foi capaz de inibir significativamente os vasorrelaxamentos induzidos por ACh de todos os grupos, porém somente nos grupo diabéticos tratados por 8 semanas com L- Arg (DL-Arg e DT + L-Arg) é que esta redução foi mais pronunciada. Isto demonstra que o tratamento com L-Arg foi capaz de aumentar a participação do NO nos vasorrelaxamentos dependentes de endotélio.

Em preparações pré-incubadas com L-NAME + INDO, os vasorrelaxamentos induzidos por ACh no grupo diabético tratado com L-Arg, foi totalmente inibido. Isto pode ser explicado pelo fato de que quando a eNOS e a ciclo-oxigenase se encontram inibidas, os efeitos dos fatores contráteis derivados do endotélio são acentuados (Shi et al., 2006). A associação do ER com a L-Arg foi capaz de aumentar a participação da via da prostaciclina dos animais diabéticos submetidos a esta combinação de tratamento, uma vez que em animais diabéticos a participação desta via nos relaxamentos induzidos por ACh são reduzidos (HARRISON et al., 1978).

Na presença dos inibidores (L-NAME + INDO + TEA), o DL-Arg apresentou uma resposta similar a encontrada na ausência de TEA, que na concentração de 1 µM torna-se um bloqueador seletivo de canais para K+ ativados por Ca2+ de alta

condutância (BKCa) (TRIGGLE et al., 2003). Além disso, foi observado que o grupo DT demonstrou um aumento na participação dos canais BKCa. Da mesma forma, Chen e colaboradores (2001) demonstraram que 8 semanas de EA em animais saudáveis aumentou a participação dos canais BKCa no vasorrelaxamento em anéis isolados de aorta e mesentérica superior. Sugerindo que tanto o EA quanto o ER são capazes de aumentar a participação dos BKCa em artéria mesentérica.

Interessantemente, a presença dos três inibidores não foi capaz de bloquear o vasorrelaxamento no grupo DS. Este fato ocorreu porque a concentração de TEA adotada neste estudo é capaz de inibir somente os canais BKCa, podendo assim, atribuir esta resposta a participação de outros tipos de canais para K+ existentes no músculo liso vascular, como por exemplo, os canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP). Existem evidências demonstrando uma maior ativação destes canais como característica das mudanças metabólicas promovidas pelo DM (CAMERON; COTTER, 1992).

7 CONCLUSÕES

O presente estudo foi o primeiro a avaliar os efeitos da L-arginina (L-Arg), do exercício resistido (ER), e da L-Arg associada ao ER, sobre a participação dos fatores relaxantes derivados do endotélio em artéria mesentérica de ratos diabéticos. Os resultados demonstram que:

1- Os tratamentos associados foram capazes de melhorar os níveis glicêmicos; 2- O tratamento com L-Arg foi capaz de evitar a perda de peso corporal

característico do DM1 e melhorar o condicionamento físico;

3- O ER demonstrou ser eficiente em melhorar o condicionamento dos animais saudáveis;

4- Os resultados de reatividade vascular demonstraram que o protocolo de exercício adotado reduziu os relaxamentos induzidos por ACh dos animais saudáveis, possivelmente por um aumento do tônus vascular;

5- Apesar de não haver melhora nos vasorrelaxamentos induzidos por ACh, o tratamento apenas com L-Arg apresentou uma maior participação do NO no vasorrelaxamento e quando associado ao ER foi observado uma maior participação da PGI2;

6- O tratamento somente com ER apresentou uma maior participação do EDHFs;

No entanto, mais estudos são necessários para melhor compreender esses efeitos.

8 PERSPECTIVAS

- Caracterizar as alterações na reatividade vascular para agentes contracturantes; - Avaliar a redução da sensibilidade a ACh encontrada no DL-Arg;

- Estudar os envolvimentos de outros canais para K+ que possam estar contribuindo para os vasorrelaxamentos do DS.

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