Efeitos da laserterapia no processo de reparo tecidual

A laserterapia de baixa potência é capaz de normalizar a função celular e otimizar o seu funcionamento, acelerando a cicatrização e a regeneração tecidual, sem produzir proliferação celular exacerbada ou transformações neoplásicas³⁵. Dentre as ações do laser que envolvem a cicatrização, destaca-se a ação reguladora sobre a inflamação nos processos iniciais da cicatrização, envolvendo mecanismos importantes como, redução de mediadores químicos (PGE2, histamina), de citocinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, TNF), diminuição da migração de células inflamatórias (leucócitos, neutrófilos), redução do edema e incremento de fatores de crescimento, contribuindo diretamente para o processo de reabilitação tecidual^47,48.

De maneira geral, a laserterapia tem implicações no aumento do fluxo sanguíneo e na oxigenação da área lesionada, devido ao aumento da microcirculação local, vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular. Em nível molecular, uma das explicações para esses efeitos é o aumento na produção ou liberação de óxido nítrico, conhecido por promover a vasodilatação. Assim, benefícios secundários a esses efeitos podem ser observados, como a adaptação de enxertos e cicatrização de feridas contaminadas, observado em estudo que

demostrou efeito inibitório na taxa de crescimento de bactérias tipo S. aureus e P. aeruginosa, in vitro e in vivo^8,49.

A ação do laser contra microrganismos é de extrema importância na cicatrização cutânea, pois, permite que mesmo contaminadas, cicatrizem em tempo semelhante ao de feridas sem previa contaminação e consequentemente, influenciando no processo inflamatório da cicatrização^35,49,50. Esse efeito da laserterapia, foi observado no tratamento de uma cadela que desenvolveu infecção secundária, após quatro laparotomias abdominais. O animal foi submetido à laserterapia de baixa potência para auxiliar na cicatrização da pele com doses iniciais de 4 J/cm² e aumentos graduais para 15 J/cm², com total de 10 sessões. O autor concluiu que a laserterapia foi eficiente para otimizar o processo de cicatrização e resolução da ferida, inferindo correlação com o efeito antimicrobiano⁵⁰.

A terapia com laser também tem outros efeitos que podem ajudar a tratar a infecção, como aumento da função dos macrófagos e produção de espécies reativas de oxigênio. As espécies reativas, estão envolvidas em processos como, produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização celular e são capazes de promover proliferação celular, o que leva importantes resultados no tratamento de feridas³⁵. O estímulo da atividade dos macrófagos, tem como consequência, aumento da atividade fagocítica e produção de fatores de crescimento capazes de modular a proliferação fibroblástica. A partir dessas considerações e resultados experimentais, observou-se que a laserterapia é capaz de modificar a infiltração de macrófagos durante o processo de reparo, o que pode estar relacionado com a diminuição da resposta inflamatória e antecipação do período de formação de fibras colágenas⁵¹.

O colágeno é o principal componente da matriz extracelular dos tecidos e a proteína mais abundante do tecido conectivo em fase de cicatrização, sendo assim, terapias que estimulem a sua deposição e organização são benéficas e importantes para a força e elasticidade das feridas em reparação^17,35. Assim, alguns estudos avaliaram o colágeno após irradiação com laser de baixa potência. Um destes estudos, investigou o comportamento de feridas cutâneas provocadas na região dorsal de ratos, submetidos a tratamento com laser de baixa intensidade (3,8 J/cm²) e observou-se na avaliação histopatológica, epiderme íntegra revestindo tecido de granulação bem desenvolvido, com tecido conjuntivo rico em fibras colágenas orientadas paralelamente à superfície da ferida, determinando um processo de reparo tecidual mais organizado¹⁰.

Outro estudo que analisou o colágeno, foi realizado por Marques⁵¹, que utilizou 64 camundongos, divididos em grupos tratado e controle, submetidos a realização de ferida cirúrgica cutâneas na região dorsal. Os animais tratados receberam irradiações a dose de 1

J/cm², por 23 segundos, em uma única aplicação diária. Nesses animais, foi observado maior deposição de fibras de colágeno tipo III, após 7 dias de lesão, em comparação ao grupo controle.

Além do colágeno, outros parâmetros presentes no processo de reparo tecidual são avaliados. Um levantamento de 18 publicações, nas quais os autores fizeram experimentos em ratos, empregando o laser de baixa potência como terapêutica na cicatrização de feridas cutâneas, constatou-se que os estudos avaliaram parâmetros macroscópicos, avaliando a redução da área da ferida. Além disso, utilizaram avaliações microscópicas, por meio de ferramentas qualitativas e quantitativas para identificar estruturas histológicas como fibroblastos, angiogênese, infiltração de leucócitos, bactérias e cobertura epitelial⁹.

Observou-se também nesse levantamento, que o ajuste da potência nos 18 estudos, variou entre 9 e 500 mW, sendo os valores mais comuns 30, 40 e 100 mW. A densidade de energia aplicada nas feridas variou entre 1 e 60 J/cm², com 3 J/cm² de dosagem como o mais comum e a média por ponto atingiu 9,6 J/cm². Em 44,4% dos casos os animais receberam doses diárias, em dia alternados 38,9%, com intervalo de três dias em 5,6% e não relatados em 11,1%

das publicações. Estes dados indicam que não existe nenhuma tendência terapêutica que possa servir como protocolo para tratamento de feridas de pele com laser de baixa potência⁹.

É importante ressaltar que a eficácia da laserterapia está intimamente ligada aos parâmetros e protocolos utilizados. Dessa forma, para a obtenção de resultados satisfatórios é preciso determinar comprimento de onda e quantidade de energia (joule) que sejam absorvidos pelos fotorreceptores do tecido inflamado, possibilitando a transformação da radiação em energia útil e benéfica para o reparo tecidual¹⁰.

1. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Avaliar os efeitos da utilização do laser de baixa potência (LBP) em doses crescentes ou fixa, na cicatrização de feridas cutâneas em ratos.

3.1.2. Objetivos específicos

• Avaliar as densidades de energia de 1 a 5 J/cm², aplicada em dias alternados nas lesões.

• Avaliar o efeito da densidade de energia de 3 J/cm² aplicada nas lesões em dias alternados.

• Comparar os efeitos da utilização das doses crescentes (1 J/cm², 3 J/cm² e 5 J/cm²) com a dose fixa de 3 J/cm².

• Caracterizar o efeito do laser de baixa potência sob os aspectos macroscópicos, microscópicos, e morfométricos de feridas cutâneas em ratos.

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CAPÍTULO 2 - LASER DE BAIXA POTÊNCIA OTIMIZA A CICATRIZAÇÃO DE FERIDA CUTÂNEA EM RATOS

RESUMO

A cicatrização tecidual é complexa e envolve diversas reações biológicas, nas quais o laser de baixa potência tem sido utilizado como instrumento terapêutico para otimizar o processo. No entanto, apesar de numerosas pesquisas sobre os seus efeitos, existe grande dificuldade em se estabelecer protocolos ideais na laserterapia. Objetivos: Avaliar os efeitos da utilização do laser de baixa potência em doses crescentes ou fixa na cicatrização de feridas cutâneas em ratos.

Material e Métodos: Foram utilizados 75 ratos machos, distribuídos em três grupos conforme a terapêutica adotada, sendo não tratados (GC), tratados com laser na dose fixa de 3 J/cm² (GLF) e tratados com laser em doses crescentes de 1 J/cm², 3 J/cm², 5 J/cm² (GLV). A lesão foi realizada com o uso de punch metálico com 9 mm de diâmetro no dorso de cada animal e o laser irradiado em dias alternados. Foram realizadas analises macroscópicas e histológicas por meio das técnicas de coloração HE e picrosirius red. Resultados: Macroscopicamente, todos os grupos tiveram fechamento completo das feridas no 19º dia após as lesoes.

Microscopicamente observou-se que no dia três após a lesão, a presença de polimorfonucleares foi menor nos grupos irradiados e o grupo GLV apresentou menor intensidade desse infiltrado em relação ao grupo GLF e GC (p < 0,05). Aos sete dias de lesão, o infiltrado de polimorfonucleares diminuiu em todos os grupos, principalmente no grupo GLV, que apresentou menor infiltrado que os demais (p<0,05). O infiltrado mononuclear foi observado em todos os tempos de avaliação microscópica, apresentando-se em maior quantidade nos grupos irradiados. No terceiro dia de lesão, o grupo GLV apresentou maior quantidade desse tipo celular (p < 0,05). Ao sétimo dia o infiltrado mononuclear apresentou-se em maior quantidade no grupo GLF (p < 0,05). Nos dias 10 e 14, o infiltrado mononuclear diminuiu em todos os grupos, e continuou apresentando-se em maior quantidade no grupo GLF (p < 0,05).

A partir do sétimo dia de lesão foi observado tecido conjuntivo vascular. No 14º dia após a lesão, observou-se tecido fibrovascular no grupo GC e em maior frequência no grupo GLV (p<0,05). Com avaliação da angiogênese observou-se no dia sete após a lesão, maior número de vasos no grupo GLF (p ˂ 0,05). No 21º dia de lesão, o grupo controle apresentou menor quantidade de vasos que os grupos irradiados (p ˂ 0,05). A quantificação do colágeno mostrou que grupos tratados com o laser apresentam maior deposição de colágeno. Conclusão: O laser de baixa potência otimizou a cicatrização das feridas, mostrando efeitos positivos, como a atenuação da inflamação aguda, com diminuição de polimorfonucleares, aumento da vascularização local, formação de tecido de granulação mais organizado e maior deposição de colágeno. A densidade de energia de 1 J/cm² é mais eficiente nos três primeiros dias da lesão, com melhores resultados na ação anti-inflamatória, enquanto que 3 J/cm² demostrou melhores resultados no sétimo dia de lesão. As densidades de energia de 3 J/cm² e 5 J/cm² a partir do 14º dia de lesão, mostraram ser benéficas para a remodelação tecidual, porém sem diferenças entre as duas.

Palavras-chave: deposição de colágeno; densidade de energia; inflamação; reparação tecidual

ABSTRACT

Tissue healing is complex and involves the different biological evaluations, in which the low power laser has been used as a therapeutic instrument to optimize the process. However, the evidence of countless research on its effects, are of great importance for the specific protocols in laser therapy. Objectives: To evaluate the effects of Low-level lasertherapy in increasing doses and in the Wound healing in rats. Material and methods: Fifty male rats were divided into three groups according to the adopted treatment, being untreated (GC), laser treated at fixed dose of 3 J/cm² (GLF) and laser treated at increasing doses of 1 J/cm², 3 J/cm², 5 J/cm² (GLV).

The lesion was performed with the use of metal punch 9 mm diameter on the back of each animal and laser irradiated on alternate days. They were performed macroscopic and histological analysis by staining techniques of HE and picrosirius red. Results:

Macroscopically, all groups had complete closure of wounds on the 19th day after lesions.

Microscopically it was observed that on the third day after the lesion, the presence of polymorphonuclear was lower in the irradiated groups and the GLV group presented lower intensity of this infiltrate in relation to the GLF and GC group (p <0.05). At the seventh day of injury, the polymorphonuclear infiltrate decreased in all groups, mainly in the GLV group, which presented lesser infiltration than the others (p <0.05). The mononuclear infiltrate was observed at all times of microscopic evaluation, being present in greater quantity in the irradiated groups. On the third day of injury, the GLV group had the highest amount of this type of cell (p <0.05). At the seventh day, the mononuclear infiltrate was higher in the GLF group (p <0.05). On days 10 and 14, the mononuclear infiltrate decreased in all groups, and continued to present a higher amount in the GLF group (p <0.05). From the 7th day of injury, vascular connective tissue was observed. On the 14th day after the lesion, fibrovascular tissue was observed in the CG group and more frequently in the GLV group (p <0.05). With the evaluation of angiogenesis, the largest number of vessels in the GLF group (p ˂ 0.05) was observed on day seven after the lesion. On the 21th day of injury, the control group had less vessels than the irradiated groups (p ˂ 0.05). The quantification of the collagen showed that groups treated with the laser present greater deposition of collagen. Conclusion: low-level laser therapy optimized wound healing, showing positive effects, such as attenuation of acute inflammation, reduction of polymorphonuclear cells, increased local vascularization, formation of more organized granulation tissue and increased deposition of collagen. The energy density of 1 J/cm² is more efficient in the first three days of the lesion, with better results in the anti-inflammatory action, whereas 3 J/cm² showed better results on the seventh day of injury. The energy densities of 3 J/cm² and 5 J/cm² from the 14th day of injury were shown to be beneficial for tissue remodeling, but without differences between the two.

Keywords: collagen deposition; energy density; inflammation; tissue repair

1. INTRODUÇÃO

Em todas as espécies animais, incluindo o ser humano, as feridas cutâneas apresentam-se como uma das lesões de maior importância na clínica cirúrgica, exigindo constantemente pesquisas por novos fármacos, materiais e terapias para a reparação tecidual.

Nesse sentido, o laser de baixa potência ganhou espaço em variadas áreas médicas, com ampla utilização na reparação tecidual, auxiliando no processo de cicatrização¹.

Alguns desses estudos foram desenvolvidos em, felinos², caninos³, camundongos⁴ e ratos⁵. Resultados como a aceleração do processo de cicatrização, modulação da resposta inflamatória, diferenciação de fibroblastos, síntese e melhor organização do colágeno e secreção de fatores de crescimento foram demostrados^2–5. Entretanto, são necessários mais estudos para a compreensão dos efeitos biológicos da interação do laser com os tecidos, parâmetros a serem utilizados, adaptação às diferentes espécies e tipos de lesões em tecidos moles. Os parâmetros, como potência e densidade de energia, são alvos de um grande número de pesquisas que buscam elucida-los e adapta-los dentro de protocolos terapêuticos^6–8.

O presente estudo analisou dois protocolos. No primeiro protocolo irradiou-se doses crescentes, iniciando com densidade de energia de 1 J/cm² nos primeiros sete dias após a indução da ferida, 3 J/cm² a partir do oitavo até o 14º dia após a lesão e 5 J/cm² entre o 15º e 20º dias, após a lesão. Esse protocolo, sugere que na fase inicial do processo cicatricial, doses menores são mais efetivas, enquanto nos estágios finais, doses mais altas são capazes de maiores estímulos à regeneração tecidual, corroborando com o que foi sugerido por Souza e colaboradores⁹. O segundo protocolo utilizou-se irradiação de 3 J/cm² durante todo o tratamento, sendo essa dose amplamente empregada em estudos experimentais com ratos^7,10–13. Os dois protocolos seguem o postulado de Túner, estabelecendo que em tecidos com injurias, como feridas abertas, baixas fluências (1 a 5 J/cm²) podem apresentar bons resultados¹⁴. Esses protocolos ainda possibilitaram na comparação entre 3 J/cm² e 1 J/cm² nos primeiros sete dias após a indução da ferida e 3 J/cm² e5 J/cm² entre o 15º e 20º dia, suscitando maiores correlações entre as densidades de energia e as fases de cicatrização. Dessa forma, buscou-se avaliar os efeitos da utilização do laser de baixa potência em doses crescentes ou fixa, na cicatrização de feridas cutâneas de ratos.

O presente estudo analisou dois protocolos. No primeiro protocolo irradiou-se doses crescentes, iniciando com densidade de energia de 1 J/cm² nos primeiros sete dias após a indução da ferida, 3 J/cm² a partir do oitavo até o 14º dia após a lesão e 5 J/cm² entre o 15º e 20º dias, após a lesão. Esse protocolo, sugere que na fase inicial do processo cicatricial, doses menores são mais efetivas, enquanto nos estágios finais, doses mais altas são capazes de maiores estímulos à regeneração tecidual, corroborando com o que foi sugerido por Souza e colaboradores⁹. O segundo protocolo utilizou-se irradiação de 3 J/cm² durante todo o tratamento, sendo essa dose amplamente empregada em estudos experimentais com ratos^7,10–13. Os dois protocolos seguem o postulado de Túner, estabelecendo que em tecidos com injurias, como feridas abertas, baixas fluências (1 a 5 J/cm²) podem apresentar bons resultados¹⁴. Esses protocolos ainda possibilitaram na comparação entre 3 J/cm² e 1 J/cm² nos primeiros sete dias após a indução da ferida e 3 J/cm² e5 J/cm² entre o 15º e 20º dia, suscitando maiores correlações entre as densidades de energia e as fases de cicatrização. Dessa forma, buscou-se avaliar os efeitos da utilização do laser de baixa potência em doses crescentes ou fixa, na cicatrização de feridas cutâneas de ratos.