Na análise em microscopia de fluorescência não foram observadas alterações morfológicas, como fragmentações nucleares e núcleos picnóticos, tanto nas células do grupo controle (não-criopreservado) quanto no grupo criopreservado (Figura 6).
Figura 6. Fotomicrografia das células-tronco da polpa de dente decíduo humano coradas com DAPI, no intervalo de 72 horas. A – grupo não-criopreservado; B – grupo criopreservado (Imunofluorescência, x40).
6 DISCUSSÃO
Os dentes decíduos humanos têm sido relatados na literatura como uma fonte promissora para obtenção de células-tronco mesenquimais, que poderão ser usadas para diversas aplicações clínicas, incluindo a engenharia de tecido dentário (MIURA et al., 2003), reparo de defeitos ósseos (ZHENG et al., 2009) e até mesmo no tratamento de lesões do tecido neural e doenças degenerativas (HUANG, GRONTHOS, SHI, 2009; MORSEZECK et al., 2010), por esta razão a importância de estudos mais avançados nesta área.
O potencial de aplicação clínico das células-tronco da polpa de dentes decíduos (SHED) é atribuído principalmente ao seu isolamento simples e conveniente e ainda à sua imunogenicidade insignificante – permitindo, assim, seu uso em transplantes alogênicos sem a utilização de imunossupressores (PIERDOMENICO et al., 2005; NOEL et al., 2007; HUANG, GRONTHOS, SHI, 2009). Por conseguinte, estas células são consideradas importantes para criação de bancos celulares, o que requer a sua conservação por longos períodos de tempo (ARORA, ARORA, MUNSHI, 2009; PETROVIC, STEFANOVIC, 2009; SLOAN, WADDINGTON, 2009).
As técnicas de criopreservação vêm sendo amplamente investigadas, com o intuito de proporcionar o armazenamento de células e tecidos a longo prazo, minimizando os danos celulares, com a finalidade de disponibilizá-los para uso posterior (XU et al., 2012). Neste sentido, tanto o procedimento de criopreservação quanto o descongelamento das células-tronco mesenquimais podem exercer importantes efeitos sobre a viabilidade e a capacidade de proliferação e de diferenciação destas células (MAMIDI et al., 2012), o que reforça a busca de protocolos simples, eficientes e seguros para a criopreservação de cada tipo celular, através de experimentos como os realizados no presente estudo.
Vários estudos têm demonstrado que células-tronco isoladas de dentes, seja do ligamento periodontal, da polpa dental e/ou da papila apical, podem ser criopreservadas com sucesso, mantendo a viabilidade após o processo de descongelamento (TEMMERMAN et al., 2008; WOODS et al., 2009; DING et
al., 2010). No presente trabalho foi possível observar que as SHEDs submetidas ao protocolo de criopreservação proposto não sofreram alteração na capacidade proliferativa, nem na viabilidade, corroborando com o proposto na literatura.
No presente estudo, a análise da proliferação celular nos grupos estudados (células não-criopreservadas e criopreservadas) demonstrou uma tendência à proliferação nos três intervalos de tempo (24, 48 e 72 horas), confirmando que as SHEDs, quando submetidas ao protocolo de criopreservação proposto, mantiveram sua capacidade proliferativa. Estes resultados são concordantes com os encontrados na literatura (OH et al, 2005; SEO et al., 2005; PERRY et al., 2008, TEMMERMAN et al., 2010; MA et al., 2012; MAMIDI et al., 2012), indicando que o processo de congelamento e descongelamento não exerce influências negativas sobre a proliferação de células-tronco mesenquimais. De fato, a curva de proliferação do presente estudo, obtida pelo método do azul de tripan, demonstra que o grupo não- criopreservado exibiu uma média maior quando comparado ao grupo criopreservado no último tempo experimental, porém sem diferença estatisticamente significante. Este dado foi confirmado nos experimentos de citometria de fluxo que avaliaram o ciclo celular, já que no intervalo de 72 horas, o percentual de células do grupo não-criopreservado que se encontravam nas fases proliferativas do ciclo (S, G2/M) era superior ao do grupo criopreservado. Observou-se que, apesar de não existirem diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, os resultados demonstraram uma tendência de proliferação maior no grupo controle, a partir de 72 horas.
Em relação ao tempo de criopreservação adotado, os estudos disponíveis na literatura relatam tempos distintos que variam desde um dia (24 horas) até intervalos maiores de tempo (PAPACCIO et al., 2006; GONDA et al., 2008). O tempo de avaliação utilizado neste trabalho baseou-se em estudos mais recentes, que avaliaram o processo de criopreservação após 30 dias (WOODS et al., 2009, TEMMERMAN et al., 2010; VASCONCELOS et al., 2012). Os resultados encontrados corroboram os destes últimos trabalhos, sem diferenças significativas na proliferação e na capacidade de diferenciação
celular das células criopreservadas quando comparadas com as não criopreservadas.
MA et al. (2012) observaram que SHEDs obtidas de tecidos pulpares criopreservados por mais de 2 anos (25-30 meses) mantinham as características de células-tronco como a capacidade de auto-renovação, multipotêncialidade, capacidade de regenerar tecidos in vitro e efeito imunomodulatório in vivo. É possível que o tempo em que as células permanecem criopreservadas possa afetar a sua viabilidade, porém períodos mais curtos como o utilizado neste estudo (30 dias) ou mais longos (25-30 meses) como o estudado por MA et al. (2012), demonstraram não serem capazes de alterar a proliferação celular.
A maioria dos protocolos de criopreservação para as células-tronco mesenquimais apresentado na literatura conserva as células em uma temperatura de -196oC (nitrogênio líquido) (GONDA et al., 2008; MARTINELLO et al., 2011; MIYAMOTO et al., 2012). Todavia, isso gera um alto custo de manutenção e não está acessível a todos os laboratórios de pesquisa. No presente estudo, utilizou-se um protocolo mais simples, mais acessível e de baixo custo, mantendo as células a uma temperatura de -80oC e ainda assim preservando a sua viabilidade.
WOODS et al. (2009) congelaram células-tronco da polpa de dentes permanentes por 1 semana, 1 mês e 6 meses em temperaturas de -196ºC (nitrogênio líquido) e -85ºC, e observaram que não houve diferença na taxa proliferativa, nem na capacidade de diferenciação celular entre os grupos estudados, em nenhum dos intervalos de tempo. Com isso, conclui-se que células expandidas em cultura podem ser armazenadas a -80/-85ºC por pelo menos seis meses e, provavelmente, por períodos de tempo maiores, sem causar danos às células, fato também comprovado neste trabalho.
A criopreservação sucessiva de células-tronco mesenquimais da medula óssea tem sido investigada por MAMIDI et al. (2012) a fim de determinar se é prejudicial para o fenótipo da célula, bem como para a capacidade de diferenciação desta célula. Para isso, CTMs de medula óssea criopreservadas na terceira passagem foram descongeladas, expandidas até a
quarta passagem, criopreservadas novamente, descongeladas e expandidas até a sexta passagem. Para o grupo controle, as células foram descongeladas e mantidas em cultura sem passar pelos processos de congelamento e descongelamento até a sexta passagem. A taxa de proliferação de ambos os grupos (controle e experimental) e a expressão de marcadores de pluripotência foram determinados e em ambas as condições de cultura, as CTMs exibiram resultados semelhantes, demonstrando que a criopreservação sucessiva não altera as características fundamentais destas células.
Entre os vários parâmetros relativos a criopreservação de células, os agentes crioprotetores também podem afetar significativamente a taxa de sobrevivência e o potencial de proliferação após o descongelamento. Optou-se por utilizar o dimetilsulfóxido (DMSO) por este ser amplamente utilizado para a criopreservação de diversos tipos celulares (PAPACCIO et al., 2006; MARTINELLO et al., 2011). Como pôde ser visto neste trabalho, esse agente forneceu resultados favoráveis em termos de viabilidade celular e capacidade proliferativa após a criopreservação das SHEDs por um período de 30 dias.
O efeito da velocidade de diminuição da temperatura no congelamento pode ser outro fator crucial para a viabilidade celular após a criopreservação e deve ser determinada para cada célula específica, afim de evitar a formação de cristais de gelo intracelular (HUBEL, 1997). Foi adotado neste estudo um protocolo padrão para outros tipos celulares em cultura, como relatado por VASCONCELOS et al. (2012): 2h a 4oC, 18h a -20ºC e armazenamento
posterior a -80°C durante um período de 30 dias, protocolo este que demonstrou ser bastante efetivo para a manutenção da viabilidade das SHEDs após o descongelamento.
XU et al. (2012), utilizando células-tronco mesenquimais humanas, avaliaram os efeitos osmóticos e do choque térmico provocado pelos procedimentos de criopreservação sobre a viabilidade e recuperação celular pós-descongelamento. Os resultados demonstraram que houve um decréscimo significativo na viabilidade das células quando utilizadas velocidades de congelamento distintas (1, 5 e 10ºC/min), sendo a velocidade de 1ºC/min a melhor para manter a morfologia e a integridade celular, como também, para
uma melhor recuperação das células após a criopreservação. Este fato contribui para a escolha de uma protocolo com decréscimo gradual e lento da temperatura de congelamento, como o utilizado neste trabalho.
THIRUMALA et al. (2005a e 2005b) estudando a criopreservação de células estaminais de tecido adiposo, comentam principalmente sobre o efeito físico que o processo de congelamento e descongelamento podem causar na integridade destas células. A partir da marcação pelo DAPI, pode-se afirmar que o protocolo de criopreservação utilizado no presente estudo manteve íntegras as membranas nucleares, bem como a morfologia do núcleo.
Os resultados obtidos através da análise em citometria de fluxo para os eventos relacionados a morte celular (apoptose e necrose) comprovam que a maioria das células manteve-se viável após os 30 dias de criopreservação. PAPACCIO et al. (2006) estudaram a influência da criopreservação de células- tronco da polpa dental por períodos mais longos (dois anos) e não identificaram morte celular por apoptose nas células submetidas à criopreservação, embora um número de células tenha sofrido necrose em virtude da formação de gelo intracelular. Este último fato não foi observado no presente estudo, já que não foram identificadas células marcadas positivamente para o iodeto de propídeo (PI). Este marcador interage com o DNA, mas não é capaz de atravessar a membrana plasmática e, quando a marcação está presente, caracteriza processos de necrose ou estagio final de apoptose.
Em geral, os resultados relacionados ao protocolo de criopreservação utilizado no presente estudo demonstram que o mesmo pode ser utilizado como uma ferramenta adequada para o armazenamento de células-tronco da polpa de dentes decíduos humanos. Estudos futuros são necessários para avaliar o potencial de diferenciação das células criopreservadas e ainda a capacidade de integração destas células com biomaterias, permitindo o seu uso posterior em experimentos in vivo, na busca por futuras aplicações clínicas em terapias de regeneração tecidual.
7 CONCLUSÃO
O protocolo de criopreservação proposto é eficiente para o armazenamento das células-tronco da polpa de dentes decíduos humanos (SHED), tendo em vista a manutenção da taxa proliferativa e da viabilidade celular, além da ausência de danos morfológicos nucleares, nos intervalos de tempo analisados.
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