C. Estudos de Citotoxidade
4. Estudos de Citotoxicidade
4.3. Efeitos do sal de zinco do [15]anoN 4 S na mitigação da citotoxicidade induzida
citotoxicidade induzida pelo Hg
2+Sabendo que para concentrações superiores a 75 µM o mercúrio(II) tem efeitos citotóxicos e tendo em conta a capacidade do ligando complexar este ião metálico (cf. Figuras 37 e 39 e Tabelas 10 e 12) coloca-se então a questão – qual a aptidão do ligando para reverter os efeitos deletérios provocados pelo Hg(II), nesta linha celular.
A capacidade do [15]anoN4S para contrariar o decréscimo da viabilidade celular induzido por Hg(II) 75 µM na proporção de 1:1, utilizando o ensaio de MTT, é apresentado na Figura 44.
Figura 44 – Efeito do macrociclo [15]anoN4S na citotoxicidade induzida
por Hg(NO3)2 (75 µM) em células MCF10A, (24 h, ensaio de MTT). Os
valores das viabilidades celulares (média ± desvio padrão de pelo menos duas experiências independentes) são expressos como percentagens em relação as células controlo não tratadas (*p>0,05 quando comparadas com as células tratadas apenas com Hg(NO3)2).
A percentagem de viabilidade celular nas células do grupo metal-ligando difere significativamente (p<0,05) do grupo controlo e das células incubadas com solução de ligando. No entanto, comparando essas mesmas células com as células referentes apenas à incubação com Hg(II), não se verifica uma diferença estatisticamente significativa (p>0,05). Pode então concluir-se que o [15]anoN4S, nestas condições experimentais, não reverte os efeitos tóxicos provocados pelo mercúrio(II).
Os resultados obtidos poderão, eventualmente, explicar-se pela formação de ligações covalentes com grupos -SH, disponíveis a nível celular, levada a cabo pelo
Hg2+. A cinética de formação destes aductos vs a formação do complexo de Hg(II) com
o [15]anoN4S, assim como a capacidade que o ligando terá de deslocar o Hg(II) de ligações covalentes, podem ser a razão de persistência de efeitos citotóxicos(22; 115; 116; 117).
Obtiveram-se resultados concordantes usando o ligando na sua forma livre (dados não exibidos).
C
ONCLUSÃO
V.
CONCLUSÃO
No presente trabalho sintetizou-se e caracterizou-se um novo composto macrocíclico com um anel de 15 membros possuindo um átomo de enxofre e quatro átomos de azoto, como átomos doadores ([15]anoN4S). Foi também avaliada, por potenciometria, a sua selectividade para os iões Cd(II), Hg(II) ou Pb(II) em detrimento de iões metálicos essenciais e de toxicidade reduzida, tendo em vista a sua potencial aplicação como agente quelante no tratamento de intoxicações pelos referidos metais pesados.
Apesar de ter sido anteriormente sintetizado, a síntese apresentava um baixo rendimento e não existia qualquer estudo potenciométrico do composto e dos seus complexos com iões metálicos.
No que respeita à síntese introduziram-se alterações no procedimento experimental adoptado na reacção de ciclização, designadamente, a utilização MeOH seco, o controlo da temperatura a 40 ºC, a utilização de um ligeiro excesso de um dos reagentes. A utilização de um agente redutor eficaz na reacção de redução da amida intermediária permitiu uma melhoria substancial do rendimento da síntese comparativamente ao descrito na literatura. Nas condições descritas obteve-se um rendimento de 68%.
Por espectroscopia de RMN (1H RMN, 13C RMN, COSY, HMQC e HMBC) e
espectroscopia de massa, procedeu-se à identificação e caracterização do produto obtido. Os dados experimentais confirmaram o elevado grau de pureza do macrociclo sintetizado (≈99%).
A determinação das constantes de protonação do ligando [15]anoN4S bem como
das constantes de estabilidade dos complexos formados com alguns catiões metálicos divalentes tais como, Ca2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+, Cd2+ e Pb2+ por técnicas potenciométricas revelou a formação de espécies mononucleares ML, MHL e de hidroxocomplexos do tipo MLOH num intervalo de pH 2-11.
Os valores das constantes de estabilidade KML dos complexos de Hg2+ e de Cu2+ com o [15]anoN4S são os mais elevados e os valores mais baixos são relativos aos complexos de Zn2+, Cd2+ e Pb2+. Verificou-se também que, nestas condições experimentais não há formação de complexo com o ião Ca2+.
Os resultados obtidos tornaram pertinente a avaliação da capacidade do ligando em ser usado como agente quelante nas intoxicações por Hg2+.
Para estudar este efeito a nível biológico foi então determinada a concentração de Hg2+ com efeitos deletérios numa linha celular humana, MCF10A, que preserva a maioria das características bioquímicas e endócrinas do tecido mamário. Definiu-se a concentração de 75 µM como uma dose nociva para a cultura celular referida. Ao mesmo tempo analisou-se a toxicidade intrínseca do ligando [15]anoN4S e do seu complexo de Zn2+. Verificou-se a existência de uma ligeira toxicidade do ligando (redução de ≈40% vs células não tratadas) sendo que o seu complexo com o Zn2+ diminuiu para metade esse efeito tóxico. O facto de a toxicidade não ser dose- dependente e do complexo com o Zn2+ apresentar menor efeito tóxico, leva-nos a pressupor que essa toxicidade pode ser atribuída à quelação de iões metálicos essenciais, existentes no meio de cultura, para as funções celulares.
Nos ensaios de reversão da toxicidade do Hg2+, o ligando em estudo não revelou capacidade para reverter os efeitos nocivos provocados pelo ião metálico, nestas condições experimentais.
Embora estando na presença de um ligando que quimicamente reúne todas as condições para se revelar um excelente agente quelante de Hg2+, nas condições biológicas utilizadas tal não se verificou. Estes resultados de difícil explicação necessitarão de estudos mais aprofundados. Em nosso entender tal facto pode relacionar-se com efeitos irreversíveis provocados pelo ião Hg2+ (ligação covalente do ião aos grupos –SH presentes em proteínas) na linha celular em questão, os quais não conseguem ser revertidos pela quelação do ião excedente.
Apesar de biologicamente o nosso ensaio ser preliminar e não permitir tirar ilações definitivas sobre a possível aplicação deste composto na terapia de quelação, pensamos contudo que se trata de um excelente agente quelante que poderá eventualmente ser aplicado a nível inorgânico (por exemplo, na remoção de mercúrio inorgânico de águas residuais).
R
EFERÊNCIAS
B
IBLIOGRÁFICAS
VI.
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