Efeitos do silenciamento da Shp2 em MVRNs.

4.1.2.1 Efeito do silenciamento da Shp2 sobre a atividade da FAK em MVRNs.

Para a avaliação do efeito do knock-down da Shp2 sobre a fosforilação da FAK, foram utilizados MVRNs sobre placa de silicone. Grupos diferentes de placas foram submetidos a tratamentos com lipofectamina, siGFP e siShp2 por 24 horas e posteriormente estirados por 10 e 60 min. As células, controle, tratadas e /ou estiradas, foram coletadas e seus extratos processados para a realização de experimentos com a técnica de western blot com anticorpos, anti-Shp2, e fosfo-específico anti-FAK-397.

Para determinar os níveis de expressão da Shp2 e expressão e fosforilação da FAK, os extratos totais foram separados através de eletroforese em gel de SDS-

poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose as quais foram então incubadas com anticorpo monoclonal contra a porção carboxi-terminal da Shp2, com anticorpos policlonais, e contra fosfo-tirosina 397 da FAK.

Conforme demonstrado no Gráfico da Figura 21 os níveis de fosforilação da FAK aumentaram expressivamente nas amostras de células tratadas com siShp2, em relação às células controle e tratadas com lipofectamina e siGFP, evidenciando que a Shp2 tem atividade regulatória sobre os níveis de fosforilação da FAK em cardiomiócitos de ratos. Ocorreu também aumento na fosforilação da FAK em resíduo tirosina nas amostras estiradas por 10 e 60 minutos tratadas com siShp2 em relação às amostras estiradas não tratadas com siShp2. O aumento, no entanto foi menor já que a fosforilação da FAK nos cardiomiócitos já aumenta significativamente após o estiramento.

Figura 20. Immunoblotting e gráfico representativo da fosforilação da FAK em resíduo de

tirosina 397 - cardiomiócitos controle e tratados somente com lipofectamina ou com siGFP. Valores percentuais médios (n = 4)

Figura 21. Immunoblotting e gráfico representativo da fosforilação da FAK em resíduo de

tirosina 397 - cardiomiócitos controle e estirados por 10 e 60 minutos, tratados ou não tratados com siShp2. Immunoblotting de GAPDH como controle da corrida protéica. Valores percentuais médios (n = 4) * p < 0,05 comparado à amostra controle

4.1.2.1.1 Efeito da inibição da atividade da Shp2 sobre a atividade da FAK em MVRNs.

4.1.2.1.1.1 Inibição da atividade da Shp2 pelo TFMS

Para examinar a influência da atividade catalítica da Shp2 sobre a fosforilação da FAK in vivo foram feitos experimentos usando o inibidor farmacológico da atividade da Shp2 TFMS.

A habilidade do TFMS de inibir a atividade fosfatase da Shp2 in vivo foi testada através de ensaio de tirosino-fosfatase in vitro usando imunoprecipitados feitos com anticorpo anti-Shp2 obtidos de extratos de MVRNs tratados com TFMS. Os resultados

do experimento de dose-resposta (Figura 22 indicaram que a inibição máxima (~50%) foi obtida com a dose de TFMS de 1.8µM (30 min), a qual tem sido descrita como serndo a dose seletiva para inibição da atividade da Shp2.

Figura 22. Immunoblotting representativo da expressão de Shp2 e gráfico representativo da

atividade tirosino-fosfatase associada ao imunoprecipitado de anticorpo anti-SHP-2 em MVRNs tratados com TFMS. Valores percentuais médios (n = 4)

Para confirmar o papel da atividade enzimática da Shp2 sobre o controle da fosforilação da FAK, foram utilizados MVRNs sobre placa de silicone. Grupos diferentes de placas foram submetidos a tratamento ou não a TFMS (inibidor farmacológico da atividade fosfatase da Shp2), por 30 min e posteriormente estirados por 10 e 60 min. As células, controle, tratadas e /ou estiradas, foram coletadas e seus extratos processados para a realização de experimentos com a técnica de western blot com anticorpos, anti-Shp2, e fosfo-específico anti-FAK-397.

Para determinar os níveis de expressão e fosforilação da FAK, os extratos totais foram separados através de eletroforese em gel de SDS- poliacrilamida e transferidos para membranas de nitrocelulose as quais foram então incubadas com anticorpos

policlonais, contra a porção carboxi-terminal da FAK e contra fosfo-tirosina 397 da FAK.

Conforme demonstrado no Gráfico da Figura 23 os níveis de fosforilação da FAK aumentaram expressivamente nas amostras de células tratadas TFMS, em relação às células controle, evidenciando que é a atividade enzimática da Shp2 responsável pela regulação dos níveis de fosforilação da FAK em cardiomiócitos de ratos. Ocorreu também aumento na fosforilação da FAK em resíduo de tirosina nas amostras estiradas por 10 e 60 minutos tratadas com TFMS em relação às amostras estiradas não tratadas com siShp2. O aumento, no entanto foi menor já que a fosforilação da FAK nos cardiomiócitos já aumenta significativamente após o estiramento.

Figura 23. Immunoblotting e gráfico representativo da fosforilação da FAK em resíduo de

tirosina 397 - cardiomiócitos controle e estirados por 10 e 60 minutos, tratados ou não tratados com TFMS. Valores percentuais médios (n = 4).* p < 0,05 comparado à amostra controle

4.1.2.2 Efeito do silenciamento da Shp2 sobre a atividade de FAK/Src, AKT, ERK e mTOR/S6K em MVRNs.

Com o objetivo de avaliar a interação da FAK com a Shp2 e o impacto desta sobre conhecidas vias de crescimento como a das MAPK e a da mTOR (A proteína mTOR modula o crescimento celular através da regulação de processos como transcrição, tradução, degradação protéica e biogênese ribossomal (INOKI K,OUYANG H,

LI Y AND GUAN KL.;2005). foram realizados experimentos em MVRNs utilizando a técnica de iRNA e western blot.

Além do aumento na fosforilação da FAK no resíduo de Tyr397, a Figura 24A mostra que o silenciamento da Shp2 aumentou a fosforilação da FAK em Tyr861 and Tyr925 e da Src em Tyr418, sugerindo que a depleção da Shp2 promove ativação do complexo de sinalização FAK/Src.

Com intuito de checar as possíveis conseqüências funcionais da deficiência da Shp2 sobre vias de sinalização “downstream” examinou-se a fosforilação das vias da ERK, AKT, e mTOR em MVRNs tratados com siShp2. A Figura 24B mostra ocorreu aumento da fosforilação de AKT Ser473, S6K Thr389 da fosforilação inibitória da TSC2 Thr1462, em MVRNs tratados com siShp2 enquanto que em relação a fosforilação da ERK Thr202/Tyr204 não foram constatadas mudanças consistentes. Na Figura 24C pode-se visualizar que o tratamento concomitante com PP2 (inibidor da atividade da FAK) aboliu a fosforilação da AKT, TSC2 (inibitória) e S6K em MVRNS tratados com siShp2.

siG FP siG FP siG FP +P P2 siG FP +P P2 siS hp 2 siS hp 2 siS hp 2 + PP 2 siS hp 2 + PP 2

Figure 24. Western Blots representativos de: A: Fosforilação e expressão da FAK Tyr861 e Tyr925,

Src Tyr418 em MVRNs não tratados (NS) e trados com siShp2. Lipofectamina or siGFP não causam mudanças no situação dessas moléculas sinalizadoras B : Fosforilação e expressão de AKT Ser473, TSC2 Thr1462, and S6K Thr389 em MVRNs não tratados (NS) e trados com siShp2. Lipofectamina or siGFP não causam mudanças no situação dessas moléculas sinalizadoras C: o Aumento da fosforilações da AKT, TSC2, e S6K induzidos pela depleção da Shp2 em MVRNs é abolido ou atenuado em resposta ao tratamento concomitante com PP2. Blots correspondem a amostras de “pools” de 3 culturas.

4.1.2.3 Efeito do silenciamento da Shp2 sobre a expressão do gene da β-Miosina. (β- MHC).

Para a avaliação do efeito do knock-down da Shp2 sobre a expressão de genes marcadores de hipertrofia, como o da β-Miosina, foram utilizados cardiomiócitos de ratos neonatos em cultura controle e tratados com lipofectamina, siGFP ou siShp2 por 24 horas. Conforme demonstrado nas Figuras 25 e 26, houve aumento substancial na expressão do gene da β-Miosina quando a Shp2 foi silenciada. Em adição, houve

atenuação desse efeito quando o silenciamento da Shp2 foi feito simultaneamente à inibição farmacológica da atividade da FAK.

Figura 25. Gráfico e PCR da expressão gênica daβ-MHC em cardiomiócitos, isolados e em

cultura, de ratos controle e submetidos ao tratamento com Lipofectamina e siGFP. Valores percentuais médios (n = 5). * p < 0,05 comparado à amostra controle

ββββ-Actina

a

Figura 26. Gráfico e PCR Multiplex da expressão gênica daβ-MHC em MVRNs controle e

submetidos ao tratamento siShp2, PP2 e siShp2 + PP2. Valores percentuais médios (n = 5). * p < 0,05 comparado. # comparado à amostra siRNA.

4.1.2.4 Avaliação do efeito do silenciamento da Shp2 sobre o tamanho dos MVRNs. Para a avaliação do efeito do knock-down da Shp2 de sobre a área dos MVRN, os cardiomiócitos controles e tratados com lipofectamina, siGFP e siShp2 por 24 horas, foram fixados em lâminas, marcados com faloidina e analisados com microscopia de fluorescência.Como mostrado na Figura 27 ocorreu um aumento de pelo menos 2,7 vezes no tamanho da área dos cardiomiócitos tratados com siShp2 em relação aos não tratados ou tratados com lipofectamina ou siGFP. Para verificar se esse aumento foi em decorrência da ativação da FAK, os MVRN foram tratados concomitantemente com siShp2 e com inibidor farmacológico da FAK PP2. Nesta situação os MVRN, tiveram um aumento no tamanho da área de 1,3 vezes.

Á re a d e S u p e rf íc ie ( µ m 2)

Figura 27. Gráfico e Imagem de microscopia de fluorescência representativos de MVRNs

submetidos a tratamento com siShp2 (24 horas), siShp2 + PP2 (10 horas),siGFP e siGFP + PP2. Aumento de 10 X 40 vezes.

Para a avaliação do efeito do knock-down da Shp2 sobre a área dos MVRN, os cardiomiócitos controles e tratados com lipofectamina, siGFP e siShp2 por 24 horas, foram fixados em lâminas, marcados com faloidina e analisados com microscopia de fluorescência.Como mostrado na Figura 28, ocorreu um aumento de pelo menos 2,7

vezes no tamanho da área dos cardiomiócitos tratados com siShp2 em relação aos não tratados ou tratados com lipofectamina ou siGFP. Para verificar se esse aumento foi em decorrência da ativação da via da mTOR/S6K, os MVRN foram tratados concomitantemente com siShp2 e com inibidor mTOR, rapamicina. Como mostrado na Figura 28 a rapamicina foi capaz de atenuar o crescimento dos MVRNs induzido pela depleção dos níveis protéicos de Shp2.

Á re a d e S u p e rf íc ie ( µ m 2) Á re a d e S u p e rf íc ie ( µ m 2)

Figura 28. Gráfico e Imagem de microscopia de fluorescência representativos de MVRNs

submetidos a tratamento com siShp2 (24 horas), siShp2 + rapamicina (10 horas), siGFP e siGFP + rapamicina. Aumento de 10 X 40 vezes.

Para confirmar que a hipertrofia dos MVRNs tratados com siShp2 (681) foi um resultados específico da depleção dos níveis protéicos celulares da Shp2 e não de possíveis alterações que pudessem ter ocorridos em outras proteínas ou outras vias de sinalização, independentes da Shp2 (efeito de off-target), foram feitos experimentos utilizando as outras seqüências de siShp2 (956 e 1442), que se mostraram menos eficientes no silenciamento da Shp2.

Como mostra a Figura 29 a alteração fenotípica dos MVRNs, tratados com siRNA da Shp2, foi específica e decorrente da depleção dos níveis protéicos celulares de Shp2. MVRNs tratados com seqüências com diferentes níveis de eficiência de silenciamento da Shp2 apresentaram diferentes e proporcionais níveis de hipertrofia celular, ou seja, os MVRNs tratados com a seqüência de siShp2 mais eficiente (que causou maior silenciamento) foram também os que apresentaram maior aumento de área de superfície, enquanto que os MVRNs tratados com a seqüência de siShp2 não eficiente foram os que apresentaram nenhum aumento na área de superfície celular quando comparados aos MVRNs controles.

A Seq-681, a qual apresentou o maior valor ∆G silenciou a Shp2 ~80% e causou o maior aumento no tamanho celular, seguida pela Seq-956 que silenciou a Shp2 em níveis aproximados a 65% induziu um crescimento celular similar ao anterior, porém um pouco menor. No entanto a Seq-1442 que apresentou a menor probabilidade de silenciamento pela menor chance de ser incorporada pelo complexo RISC (Por apresentar menor valor de ∆G ) não induziu mudança nos níveis protéicos celulares de Shp2 ou no tamanho dos MVRNs.

Figura 29. Gráfico de valores médios de área de superfície de MVRNs tratados com siGFP ou

siRNA (Seq-681, Seq-956 and Seq-1442). * P<0.05 comparados a valores referentes a MVRNs tratados com siGFP. Magnificação 10x40 vezes

4.1.2.5 Avaliação do efeito do silenciamento da Shp2 sobre o localização da FAK em MVRNs.

A atividade e função de proteínas de sinalização guardam relação estreita com sua localização em estruturas sub-celulares. Técnicas de imunohistoquímica associadas

Á re a d e S u p e rf íc ie ( µ m 2 ) Á re a d e S u p e rf íc ie ( µ m 2 )

a microscopia de fluorescência permitem localizar proteínas em sítios sub-celulares,. Com intuito de examinar as possíveis alterações na localização da FAK, em MVRNs tratados com siShp2, decorrentes de seu estado de ativação, MVRNs tratados com siShp2 ou si GFP, as células foram extraídas fixadas em lâminas, marcadas com anticorpos anti-FAK e analisadas com microscopia de fluorescência

Como mostrado na Figura 30, em MVRNs tratados com si GFP, a FAK (marcação verde) se localiza no citoplasma, preferencialmente junto às miofibrilas e também na região perinuclear. Já em MVRNs tratados com siShp2 (nos quais supostamente a FAK encontra-se ativa, a localização é ainda miofibrilar, mas passa a ser nuclear ao invés de perinuclear.