EFEITOS DO VANADATO, INIBIDORES E SUBSTRATOS SOBRE A

Os resultados obtidos neste trabalho envolvendo o mecanismo de inibição de ABCG2 sugerem que os inibidores se fixam em um sítio diferente do sítio de transporte e provocam mudanças conformacionais impedindo o transporte do substrato, podendo ocorrer de maneira parcial ou completa. Para investigar essa hipótese, foram realizados ensaios utilizando um anticorpo conformacional chamado 5D3. O anticorpo 5D3 reconhece um epítopo extracelular localizado em uma volta de ABCG2, localizada entre os domínios transmembrana 5 e 6.

As células HEK293ABCG2 foram expostas por 30 minutos à diferentes substratos de ABCG2, os quais não emitem fluorescência na mesma faixa que a ficoeritrina (fluoróforo acoplado ao 5D3). Após incubação dos substratos (SN-38, hoechst 33342, topotencan e quercetina) em concentrações saturantes, as células foram expostas ao anticorpo. Como apresentado na figura 48, aparentemente os substratos não alteraram, ou muito pouco, a fluorescência emitida, sugerindo que os

substratos não alteram a estrutura de ABCG2 ao nível de reconhecimento do epitopo do 5D3.

Para avaliar como os inibidores de ABCG2 se comportam, foram avaliados a capacidade dos mesmos 4 inibidores (GF120918, Ko143, cromona 6a e estilbeno 9) em modificar a interação do anticorpo 5D3 ao transportador ABCG2. Todos inibidores capazes de bloquear 100% do transporte de substratos por ABCG2 também promoveram um aumento na fluorecência emitida pelo 5D3, confirmando que inibidores provocam alterações conformacionais em ABCG2 levando ao bloqueio do transporte de substratos (figura 48). Estes resultados estão de acordo com os dados obtidos pela equipe do Dr. Sarkadi (laboratório que caracterizou o uso do anticorpo 5D3), onde foi observado que alguns inibidores de ABCG2 aumentam a intensidade de fluorescência emitida pelo 5D3 (TELBISZ et al., 2012). Outro resultado interessante foi que o estilbeno 9 não alterou a fluorescência do 5D3, sugerindo que esse inibidor se fixa em um sítio diferente dos outros inibidores, não alterando a acessibilidade do anticorpo 5D3 por promover efeitos conformacionais diferentes dos outros inibidores (figura 48).

FIGURA 48 – EFEITOS DO VANADATO, INIBIDORES E SUBSTRATOS SOBRE A INTERAÇÃO DO ANTICORPO CONFORMACIONAL 5D3 À ABCG2

FONTE: O Autor (2012)

NOTA: Foi avaliado o efeito do vanadato, substrato e inibidores na fixação do anticorpo 5D3 em células HEK293ABCG2. A fluorescência (GMean) foi monitorada por citometria de fluxo usando 20 µL do anticorpo 5D3 conjugado com ficoeritrina, ou 20 µL do anticorpo controle (IgG2b), também conjugado com ficoeritrina como descrito na seção de Materiais e Métodos item 4.29. Foram realizados dois experimentos independentes e os resultados normalizados ao controle (ausência de compostos).

Para continuar explorando o mecanismo de inibição de ABCG2, as células HEK293ABCG2 foram incubadas com 5 mM de vanadato (Vi), o qual é um análogo

estrutural do fosfato e com maior afinidade, assim, o vanadado forma um complexo estável com o ADP (Vi-ADP) impedindo a liberação de ADP para que uma nova molécula de ATP se fixe (CANTLEY et al., 1977). Como resultado da hidrólise do ATP em um primeiro ciclo de transporte, temos a estrutura do transportador aberta para o exterior e na presença de vanadato essa conformação é bloqueada. A exposição de 5 mM de vanadato por 10 minutos diminui a fluorescência emitida pelo anticorpo 5D3 (figura 48), confirmando alterações conformacionais, podendo sugerir que a estrutura aberta ao exterior aumenta a acessibilidade ao 5D3 e mais fechada, diminui.

Novamente foi observado que os substratos não alteram a fluorescência emitida pelo anticorpo 5D3 após prévia exposição ao vanadato (figura 49), confirmando o resultado obtido na ausência de vanadato. Foi observado que tanto o GF120918 quanto o Ko143 apresentaram a mesma tendência em aumentar a fluorescência do 5D3 (figura 49), tanto na presença quanto ausência de vanadato. Em contraste, a cromona 6a apresentou um efeito inverso, diminuindo a acessibilidade do 5D3, sugerindo um sítio diferente do GF120918 e Ko143 (figura 49). O mesmo efeito de diminuição da fluorescência emitida pelo anticorpo 5D3 foi observado com o estilbeno 9, confirmando a presença de um outro sítio de fixação para essa classe de inibidores (figura 49).

FIGURA 49 – EFEITOS DO VANADATO, INIBIDORES E SUBSTRATOS SOBRE A INTERAÇÃO DO ANTICORPO CONFORMACIONAL 5D3 À ABCG2 APÓS EXPOSIÇÃO AO VANADATO

FONTE: O Autor (2012)

NOTA: Foi avaliado o efeito dos substratos e inibidores na fixação do anticorpo 5D3 em células HEK293ABCG2 após exposição a 5 mM de vanadato por 10 minutos. A fluorescência (GMean) foi monitorada por citometria de fluxo usando 20 µL do anticorpo 5D3 conjugado com ficoeritrina, ou 20 µL do anticorpo controle (IgG2b), também conjugado com ficoeritrina de acordo com a seção de Materiais e Métodos item 4.29. Foram realizados dois experimentos independentes e os resultados normalizados ao controle tratado com vanadato.

Vários ensaios diferentes (atividade ATPase, tipo de inibição e bi-modulação) sugerem que o GF120918 e o estilbeno 9 possuem sítios de inibição diferentes. Para confirmar esses resultados, foi realizado um ensaio com GF120918 e o estilbeno 9 em duas concentrações diferentes sobre a acessibilidade do anticorpo conformacional 5D3 após exposição ao vanadato (figura 50). Esses resultados cofirmam os resultados prévios indicados na figura 49 e mostram que o efeito sobre a acessibilidade do anticorpo 5D3 não é dependente da concentração do inibidor, pois utilizando os inibidores na concentração de 1 µM o efeito foi semelhante ao observado com a utilização de 5 µM do inibidor, tanto para o GF120918 quanto para o estilbeno 9 (figura 50). Esses resultados obtidos com uso do anticorpo conformacional 5D3, onde o GF120918 é capaz de aumentar a acessibilidade do anticorpo e o estilbeno 9 têm efeito inverso (na presença de vanadato = estrutura aberta ao exterior), sugerem que o estilbeno 9 apresenta prefência para se fixar quando a estrutura do transportador ABCG2 está aberta, já que na ausência de vanadato (estado basal), o estilbeno 9, não apresentou efeito sobre a acessibilidade do anticorpo 5D3 (figura 48). Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que substratos não induzem mudanças conformacionais detectáveis pelo uso do anticorpo 5D3 e que diferentes inibidores se comportam de diferentes maneiras, provavelmente devido a existência de sítios de inibição distintos no transportador ABCG2.

FIGURA 50 – EFEITOS DO GF120918 E ESTILBENO 9 SOBRE A INTERAÇÃO DO ANTICORPO CONFORMACIONAL 5D3 À ABCG2 APÓS EXPOSIÇÃO AO VANADATO

FONTE: O Autor (2012)

NOTA: Foi avaliado o efeito do GF120918 na fixação do anticorpo 5D3 em células HEK293ABCG2 após exposição a 5 mM de vanadato por 10 minutos. A fluorescência (GMean) foi monitorada por citometria de fluxo usando 20 µL do anticorpo 5D3 conjugado com ficoeritrina, ou 20 µL do anticorpo controle (IgG2b), também conjugado com ficoeritrina como descrito na seção de Materiais e Métodos item 4.29.