encontrada em quase todos os organismos vivos, incluindo plantas superiores, fungos e bactérias. Apesar da aparente diversidade na natureza de substratos primários, estrutura química e propriedades dos pigmentos resultantes, há uma característica comum da melanogênese de plantas e de animais, que é a enzima tirosinase, a qual catalisa as principais etapas do processo (Prota, 1980).
A tirosinase é uma proteína codificada pelo locus TYR que está no cromossomo 11 em seres humanos, mas possui estrutura proteica altamente conservada entre as diferentes espécies e, também, homologia para outras proteínas a ela relacionadas, como a TRP-1 e a TRP-2. É sintetizada no retículo endoplasmático como uma proteína precursora de cadeia nascente, sendo processada no complexo de Golgi, onde é glicosilada. A glicosilação é importante para fazer a associação da molécula no melanossomo como também para a sua atividade (Slominski et al., 2004).
Tirosinase purificada obtida de Agaricus bisporus
Após estudar a influência dos extratos de Passiflora quanto à toxicidade em linhagem B16F10, os mesmos foram testados com relação aos efeitos sobre a atividade de tirosinase. Para tanto, os extratos fluidos e AK (inibidor da tirosinase) foram adicionados de L-DOPA e de tirosinase purificada. A L-DOPA, quando convertida a dopacromo pela enzima, absorve luz UV em 450 nm. Os resultados
estão apresentados relativos à atividade de tirosinase do controle, onde não houve adição de AK, HQ ou de extratos, e para o qual se atribuiu o valor de 100%.
Com o intuito de verificar qual seria a concentração ideal em termos de atividade, expressa em Unidades Internacionais (UI), de tirosinase purificada a ser utilizada nos experimentos, estabeleceu-se a potência da enzima e a partir dela, fez-se uma triagem com cada um dos extratos de Passiflora na concentração de 100 µg/mL, fixando-se também a quantidade de L-DOPA (5 mM) usado como substrato de ação enzimática. Como inibidor da atividade de tirosinase, nesta série de experimntos, utilizou-se o AK a 400 µM.
Os efeitos obtidos estão na Figura 23, onde o AK inibiu significativamente, como esperado, a atividade de tirosinase em 31,0±7,3% (p<0,001). Em relação aos extratos, somente os de P. alata e de P. edulis inibiram significativamente a enzima em 11,0±2,6% e 10,0±2,9%, respectivamente.
Figura 23. Efeitos dos Extratos de Passiflora sobre a Atividade de Tirosinase de Cogumelo.
Solução contendo tirosinase de cogumelo (5 UI) e 5 mM de L-DOPA (controle) foi exposta ao ácido kójico (AK) ou aos extratos indicados de Passiflora a 100 ug/mL, seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada barra representa a porcentagem média±DP de dopacromo formada em relação ao controle, normalizado em 100%, obtida de 4 experimentos independentes. *p<0,05;
***p<0,001 em relação ao controle.
A partir dessa série experimental, somente diferentes concentrações dos extratos de P. alata e de P. edulis que agiram sobre a atividade de tirosinase foram utilizadas. Em seguida, foram analisados os efeitos da HQ em ensaio semelhante e os resultados estão ilustrados na Figura 24.
25 100
Solução contendo tirosinase de cogumelo (5 UI) e 5 mM de L-DOPA (controle) foi exposta à hidroquinona (HQ), ao ácido kójico (AK) ou ao extrato de P. alata nas concentrações indicadas, seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada barra representa a porcentagem média±DP de dopacromo formada em relação ao controle, normalizado em 100%, obtida de 4 experimentos independentes. **p<0,01; ***p<0,001 em relação ao controle.
Neste experimento, observou-se que, enquanto a HQ significativamente inibiu em 8,0±2,1% a atividade da enzima (p<0,01), o AK o fez de forma bem mais intensa, com 36,0±3,0% (p<0,001). Já o extrato de P. alata, em diferentes concentrações, inibiu a atividade tirosinásica a partir de 100 µg/mL, com inibição de 11,0±2,1%. Para as concentrações de 250, 500, 750 e 1000 µg/mL a inibição foi de 9,0±0,6, 20,0±2,3, 28,0±1,0 e 23,0±6,6%, respectivamente. Com esses resultados, pôde-se verificar que um platô de inibição de atividade enzimática foi estabelecido a partir de 500 µg/mL.
Este mesmo experimento foi realizado com o extrato de P. edulis, e os resultados estão na Figura 25.
Nesse experimento, a HQ inibiu significativamente a atividade de tirosinase em 12,0±5,6% (p<0,05) e o AK em 40,0±3,0% (p<0,001). Já o perfil do extrato de P.
edulis foi semelhante ao apresentado pelo de P. alata, onde, a partir de 100 µg/mL observou-se 11,0±2,0% (p<0,05) de inibição enzimática. Nas concentrações de 250, 500, 750 e 1000 µg/mL, a inibição observada foi de 17,0±6,6 (p<0,01), 23,0±5,0 (p<0,001), 24,0±10,2 (p<0,001) e 27±4,6% (p<0,001), respectivamente. A partir desses resultados, pôde-se verificar também que o aumento da concentração do extrato alcança um platô em torno de 500 µg/mL.
25 100
Solução contendo tirosinase de cogumelo (5 UI) e 5 mM de L-DOPA (controle) foi exposta à hidroquinona (HQ), ao ácido kójico (AK) ou ao extrato de P. edulis nas concentrações indicadas, seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada barra representa a porcentagem média±DP de dopacromo formada em relação ao controle, normalizado em 100%, obtida de 4 experimentos independentes. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 em relação ao controle.
Uma vez que a concentração de 100 µg/mL demonstrou ser a maior concentração não tóxica de cada extrato para as células e que com a mesma obteve-se efeito inibitório significativo sobre a ação da tirosinase, optou-se por utilizar essa concentração nos experimentos subsequentes.
Conhecendo-se os mecanismos de ação do AK e da HQ, sugeriu-se um mecanismo de ação para P. alata e P. edulis através de experimentos com esses dois inibidores clássicos da tirosinase. Primeiramente, utilizou-se concentração fixa de L-DOPA e de tirosinase e variaram-se as concentrações de cada um dos -DOPA (1,25; 5 e 8,75 mM), o AK a 400 µM alterou seu perfil inibitório, que aumentou de acordo com o aumento da concentração. Esses resultados podem ser visualizados nas Figuras 26 e 27, relembrando que esses experimentos foram realizados em duplicata, justificando assim a ausência do desvio padrão nos gráficos.
0 200 400 600 800 1000 0
20 40 60 80 100
AK (µµµµM) atividade de tirosinase purificada (%)
Figura 26. Perfil de Ação do Ácido Kójiko sobre a Atividade de Tirosinase de Cogumelo (I).
As concentrações indicadas de Ácido Kójico (AK) foram adicionadas a uma solução contendo tirosinase de cogumelo (5UI) e 5 mM de L-DOPA seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Experimento realizado em duplicatas independentes.
0 2 4 6 8 10
0 20 40 60 80 100
L-DOPA (mM) atividade de tirosinase purificada (%)
Figura 27. Perfil de Ação do Ácido Kójiko sobre a Atividade de Tirosinase de Cogumelo (II).
As concentrações indicadas de L-DOPA, foram adicionadas a uma solução contendo tirosinase de cogumelo (5 UI) e ácido kójicvo (400 µM) seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada ponto representa a atividade enzimática em relação ao controle (n=2).
Em ensaios semelhantes com a HQ, variando-se sua concentração entre 10 e 50 µM e fixando-se as concentrações de enzima e de substrato, observou-se que, quanto maior sua concentração menor foi o efeito inibitório (Figura 28).
0 20 40 60
0 20 40 60 80 100
HQ (µµµµM) atividade de tirosinase purificada (%)
Figura 28. Perfil de Ação da Hidroquinona sobre a Atividade de Tirosinase de Cogumelo (I).
As concentrações indicadas de hidroquinona (HQ) foram adicionadas a uma solução de tirosinase de cogumelo (5 UI) contendo 5 mM de L-DOPA seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada ponto representa a percentagem de atividade enzimática relativa ao controle (n=2).
Nesse experimento confirmou-se que as concentraçãos inibitórias de HQ que deveriam ser utilizadas no sistema reacional estão entre 2,5 µM e 5 µM, relembrando que esse experimento foi realizado em duplicata, justificando, portanto, a ausência do desvio padrão no gráfico.
No experimento em que concentrações crescentes de HQ foram utilizadas, fixando-se a de L-DOPA, inicialmente realizou-se um estudo piloto com concentrações entre 50 e 400 µM de HQ. Neste estudo verificou-se que não houve inibição da atividade tirosinásica e, sim, estímulo da atividade da enzima, ou seja, os resultados ultrapassaram o valor de 100% (estudo experimental não demonstrado).
Assim, para atingir a concentração ideal de inibição, as concentrações foram sendo diminuídas. Como já demonstrado, o aumento da concentração de HQ (10 a 50 µM) não levou à inibição da atividade enzimática; porém, entre 2,5 µM e 5 µM, este efeito foi observado; consequentemente, a concentração de 5 µM de HQ foi, então, escolhida para a realização do ensaio, cujos resultados estão demonstrados
na Figura 29, onde observa-se que, com o aumento da concentração de L-DOPA,
Figura 29. Perfil de Ação da Hidroquinona sobre a Atividade de Tirosinase de Cogumelo (II).
As concentrações indicadas de L-DOPA foram adicionadas a solução contendo tirosinase de cogumelo (5 UI) e 5mM de hidroquinona seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada ponto representa a atividade enzimática em relação ao controle (n=2).
Em relação aos extratos de P. alata e de P. edulis, fixando-se concentração em 100 µg/mL,m observou-se que, com o aumento da concentração de substrato (L -DOPA), não houve efeito, como pode ser observado nas Figuras 30 e 31,
Figura 30. Perfil de Ação do Extrato de Passiflora alata sobre a Atividade de Tirosinase de Cogumelo. As concentrações indicadas de L-DOPA foram adicionadas a solução contendo 100 µg/mL de Extrato de P. alata e tirosinase de cogumelo (5UI) seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada ponto representa a atividade enzimática em percentagem (n=3).
0 2 4 6 8 10 Cogumelo. As concentrações indicadas de L-DOPA foram adicionadas a solução contendo 100 µg/mL de Extrato de P. edulis e tirosinase de cogumelo (5 UI) seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada ponto representa a atividade enzimática em relação ao controle (n=3).
Para maior entendimento do mecanismo de ação dos extratos de P. alata e de P. edulis, estes, assim como os inibidores HQ e AK, foram incubados juntamente com 500 µM de L-tirosina na presença de L-DOPA. Nesse caso, a incubação da
Figura 32. Perfil de Ação dos Extratos de P. alata e P. edulis na Presença de Tirosina sobre a Atividade de Tirosinase de Cogumelo. As concentrações indicadas de hidroquinona (HQ), ácido kójico (AK) ou dos extratos de P. alata e P. edulis foram adicionadas a uma solução contendo tirosinase de cogumelo (5 UI), L-tirosina (L-tyr) e L-DOPA (5 mM) seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada barra representa a porcentagem média±DP de dopacromo formada em relação ao controle, normalizado em 100%, obtida de 4 experimentos independentes. ***p<0,001 em relação ao controle.
Esses resultados demonstraram que, em relação ao controle, o AK, mesmo incubado na presença de L-tirosina, inibiu significativamente a ação da tirosinase em 23,0±6,0% (p<0,001), corroborando com seu efeito irreversível; em contraste, a HQ, teve seu efeito revertido e semelhante ao abservado para com os extratos de P.
alata e de P. edulis, sugerindo para ambos um mecanismo de ação semelhante ao descrito para a hidroquinona.
Tirosinase murina obtida de células B16F10
Com a finalidade de se observar se os efeitos obtidos com a tirosinase de cogumelo se manteriam quando uma enzima proveniente de outra fonte fosse utilizada, propusemos os mesmos ensaios usando tirosinase murina, a qual foi obtida do lisado de células B16F10 cultivadas de rotina em nosso laboratório. Assim, a cada extrato, AK ou HQ, na presença de L-DOPA diluída em tampão adequado, foi adicionado lisado celular (LC) contendo tirosinase murina. Preliminarmente, concentrações de 50, 100 e 200 µg/mL de proteínas totais (PT) do LC foram, então, utilizadas, variando-se a concentração de L-DOPA (2,5 mM e 5 mM); as melhores absorvâncias obtidas resultaram da combinação de 200 µg/mL de PT de LC e 2,5 mM de L-DOPA. Os resultados dos extratos sobre a atividade de tirosinase murina podem ser observados na Figura 33, onde a HQ e o AK inibiram significativamente a atividade enzimática em 14,0±5,6 e 31,0±9,1%, respectivamente, assim como os extratos de P. alata e de P. edulis, cujos valores de inibição foram de 21,0±5,5 e 16,0±4,6%, respectivamente.
Em seguida, como realizado com a tirosinase purificada de cogumelo, os experimentos de incubação de cada um dos inibidores clássicos (HQ e AK) e de cada extrato (P. alata e P. edulis) com 500 µM de L-tirosina sobre a atividade de tirosinase murina foram realizados para verificar se a ação inibitória desses extratos sobre a atividade de tirosinase murina também seria modulada quando na presença de L-tyr. Nesse caso, foi considerado como controle experimental o ensaio com L -tirosina, para o qual foi atribuído o valor de 100%. O resultado pode ser avaliado na Figura 34.
Nesse experimento pode-se observar que, na presença de L-tirosina, em relação ao controle, o AK manteve seu perfil clássico, inibindo a atividade de tirosinase em 34,0±7,5% como esperado; já a HQ teve o efeito inibitório revertido.
Em relação aos extratos de P. alata e de P. edulis, os mesmos também tiveram seus
efeitos de inibição de atividade de tirosinase revertidos, repetindo o perfil de ação demonstrado com a tirosinase de Agaricus bisporus.
0
Figura 33. Efeitos dos Extratos de P. alata e de P. edulis sobre a Atividade de Tirosinase Murina.
Solução de lisado celular contendo 200 µg/mL de proteínas totais e 2,5 mM de L-DOPA (controle) foi exposta à HQ (hidroquinona), ao ácido kójico (AK) ou aos extratos de P. alata e P.
edulis nas concentrações indicadas, seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada barra representa a porcentagem média±DP de dopacromo formado em relação ao controle, normalizado em 100%, obtida de 4 experimentos independentes. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 em relação ao controle.
0
Figura 34. Efeitos dos Extratos de P. alata e de P. edulis sobre a Atividade de Tirosinase Murina na Presença de Tirosina. Solução contendo lisado celular obtido da linhagem B16F10 (200 µg/mL de proteínas totais) e 2,5 mM de L-DOPA foi adicionada de L-tirosina (L-tyr 500 µM) isoladamente (controle) ou incubada juntamente com hidroquinona (HQ) ou ácido kójico (AK) ou com cada um dos extratos nas concentrações indicadas, seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada barra representa a porcentagem média±DP de dopacromo formada em relação ao controle, normalizado em 100%, de 4 experimentos independentes. ***p<0,001 em relação ao controle.
Efeito da Associação dos Extratos com os Inibidores Clássicos da Tirosinase
De acordo com Oga e colaboradores (2002), quando duas drogas possuem mecanismos de ação semelhantes, seus efeitos são aditivos, como ocorre com o ácido acetilsalicílico e a dipirona, onde ambos inibem a ciclooxigenase atuando como analgésicos antitérmicos. Quando duas drogas possuem efeitos semelhantes, porém atuando por diferentes mecanismos, têm-se a somação; é o caso do ácido acetilsalicílico, que atua como analgésico por mecanismo periférico, e da codeína, que atua por ação central. Ainda existe o conceito de potencialização por sinergismo, onde o efeito resultante da associação de duas drogas é maior do que a soma ou adição de cada um, como é o caso da associação de um tranquilizante com a bebida alcoólica, que resulta em depressão do sistema nervoso central.
Agentes clareadores de pele são amplamente utilizados em preparações de uso dermatológico com a finalidade de tratar hiperpigmentações. A associação de dois ou mais despigmentantes poderá promover sinergismo, em que os efeitos combinados poderão ser maiores do que a soma dos efeitos individuais.
As preparações dermatológicas clareadoras de pele contendo associação de HQ e AK são muito comuns (Nicoletti et al., 2009) e possuem o sinergismo como efeito farmacológico; desse modo, nessas formulações as concentrações de HQ e de AK sao minimizadas, reduzindo-se assim os efeitos colaterais, como por exemplo, a formulação de AK e HQ ambos a 2% (Deprez, 2009).
Com a finalidade de verificar o efeito associativo dos extratos com os inibidores clássicos da atividade de tirosinase, foi testada metade das concentrações utilizadas de cada uma destas substâncias, ou seja, HQ = 2,5 µM; AK = 200 µM;
extratos de P. alata e de P. edulis = 50 µg/mL. Esse experimento foi realizado somente com a tirosinase murina, uma vez que é a enzima mais semelhante à tirosinase humana do que aquela obtida de Agaricus bisporus. O controle experimental foi considerado o lisado celular (200 µg/mL de proteínas totais) contendo somente 2,5 mM de L-DOPA. A Figura 35 mostra os resultados obtidos.
0 indicadas, seguida de incubação a 37 ºC por 1 hora. Em seguida, quantificou-se a formação de dopacromo em 450 nm. Cada barra representa a porcentagem média±DP de dopacromo formada em relação ao controle, normalizado em 100%, obtida de 3 experimentos independentes. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 em relação ao controle.
Ou seja, em relação ao controle, tanto a HQ como o AK inibiram a atividade de tirosinase em 14,0±4,0 e 26,0±11,0%, respectivamente, repetindo as ações já descritas. Quando em associação, isto é, o AK associado à HQ, ao extrato de P.
alata (50 µg/mL) ou ao de P. edulis (50 µg/mL), inibiram a atividade tirosinásica, respectivamente, em 56,0±5,6, 68,0±10,7 e 76,0±7,1%.O resultado da associação de cada extrato com o AK demonstrou ação enzimática inibitória significativamente maior (p<0,001) do que aquela obtida com a associação entre a HQ e o AK. Assim, pode-se sugerir que quando o AK está associado a HQ ou aos extratos de P. alata ou de P. edulis há efeito sinérgico.
Em franco contraste, no caso da associação desses mesmos extratos com a HQ, obteve-se estímulo enzimático significativo de 36,0±8,5% para o extrato de P.
alata, e de 24±4,9% para o extrato de P. edulis (p<0,001). Assim, os resultados indicam que há efeito aditivo quando a HQ está associada ao extrato de P. alata ou ao de P. edulis. Esta reversão de efeito pode ser decorrente da presença de uma ou mais substâncias presentes nessas misturas que, de certa forma, disponibilizaram uma maior quantidade de HQ para que esta pudesse agir sobre a tirosinase, uma vez que, em nenhum ensaio realizado anteriormente, os extratos mostraram-se aptos a estimular a atividade de tirosinase.
Interessante ressaltar que os extratos de P. actinia e de P. incarnata não demonstraram algum tipo de efeito sobre a atividade de tirosinase, e isto pode ser resultante do fato de não possuírem as substâncias que atuem sobre a enzima, ou por possuírem essas substâncias em baixas concentrações em decorrência, por exemplo, da época em que se procedeu a coleta do material ou mesmo das condições do solo. Ainda, esses extratos foram os únicos a apresentarem elevada quantidade de isovitexina quando comparados aos de P. alata e de P. edulis, indicando não ser esta substância a responsável pelo efeito inibitório da atividade tirosinásica. O extrato de P. incarnata também registrou o maior teor de flavonoides totais em relação aos outros extratos e, mesmo assim, não demonstrou ação sobre a enzima.
Assim como os flavonoides, as saponinas, presentes no extrato de P. alata, dependendo da estrutura, podem inibir a melanogênese. Como já descrito na introdução deste trabalho, saponinas foram isoladas de botões de flores de Camellia japonica, espécie cultivada no Japão, China e Taiwan. Dentre as saponinas triterpênicas que inibiram drasticamente a melanogênese sem efeitos citotóxicos estão as sasanquasaponinas I e II, que possuem um grupo acila na posição 22 (Nakamura et al., 2012).
Assim, uma ou mais substâncias presentes nos extratos de P.alata e de P.edulis contribuíram para a inibição da atividade de tirosinase, provavelmente por possuírem estrutura(s) química(s) semelhante(s) à da hidroquinona (HQ).
CONCLUSÕES
Neste trabalho, os efeitos dos extratos fluidos preparados das folhas de P.
alata, P. edulis e P. actinia e do extrato seco das folhas de P. incarnata sobre a atividade de tirosinase foram avaliados com a finalidade de se observar seu potencial terapêutico para o tratamento de doenças de pele com desvios de pigmentação.
O teor de polifenóis totais, assim como o de compostos fenólicos desses extratos, à excessão do de P. incarnata que não pode ser analisado, foi muito semelhante e, de acordo com os resultados da CCD, todos mostraram ser ricos em flavonoides e, em particular, em isovitexina, molécula marcadora da espécie.
O ensaio do MTT foi útil em demonstrar que até 100 µg/mL, esses extratos não alteram a fisiologia de células B16F10 quando submetidas a um esquema rotineiro de manutenção.
Nos ensaios com tirosinase de cogumelo e murina, efeitos inibitórios significativos sobre a atividade foram observados somente para os extratos de P.
alata e de P. edulis, cujo perfil foi semelhante ao apresentado pela hidroquinona, indicando um mecanismo de ação similar.
Como o interesse em se obter substâncias naturais que atuem em situações relacionadas a hiperpigmentação da pele é crescente, estudos que levem ao isolamento e identificação de uma ou mais substâncias responsáveis pelos efeitos aqui descritos devem ser estimulados, particularmente por se tratar de espécies que crescem de forma exuberante em terras tropicais.
REFERÊNCIAS
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