Efeitos sobre a viabilidade e proliferação

Na avaliação da citotoxicidade in vitro de compostos com potencial atividade anticâncer a cultura de células é muito utilizada (CHIBA et al., 1998; ŚLIWKA et al., 2016).

Esse modelo experimental permite avaliar, por exemplo, a viabilidade e proliferação celulares frente a estes compostos (ŚLIWKA et al., 2016). Diferentes métodos podem ser utilizados para avaliar estes parâmetros, entre os mais acessíveis estão o método do MTT e do Cristal Violeta. O Ensaio do MTT é baseado na redução de sais de tetrazólio em cristais de formazana, por desidrogenases de células viáveis (BANASIAK et al., 1999; ŚLIWKA et al., 2016).

As preparações das galactomananas apresentaram diferentes perfis em relação à diminuição da viabilidade celular nas concentrações e tempos avaliados. Após 24 h de tratamento, os biopolímeros mostraram baixa toxicidade, com maior efeito para SAGM e MSAGM:VO, que promoveram redução de ~ 24% na viabilidade das células HepG2 na concentração de 250 µg/mL em relação ao controle, células incubadas somente com o meio de cultura (FIGURA 22 A). Nesta mesma concentração, em 48 h de incubação, SAGM e MSAGM:VO mostraram-se mais citotóxicos diminuindo a viabilidade em ∼34 % e ∼ 54 %, respectivamente (FIGURA 22 B). Este perfil se manteve em 72 h para MSAGM:VO, porém SAGM foi mais citotóxico quando comparado ao tempo de 48 h, promovendo ~51% de redução da viabilidade destas células (FIGURA 22 C). As outras preparações (MSAGM e SAGM:VO), na concentração de 250 µg/mL, reduziram a viabilidade celular em torno de 18

% e 21 %, respectivamente em 72 h de tratamento. De acordo com os resultados mostrados na figura 22 C, a preparação nativa da galactomanana (SAGM) foi mais citotóxica em relação às demais preparações, uma vez que em 72 h afetou a viabilidade das células HepG2 em ~ 50%

a partir da concentração de 50 µg/mL. Similar intensidade foi observada para MSAGM:VO, porém, em concentração 5 vezes maior (250 µg/mL) no mesmo tempo de tratamento.

O outro método para avaliação de viabilidade celular utilizado no presente estudo foi o método do cristal violeta, que considera como células viáveis, aquelas que permanecem aderidas as placas de cultura. Neste caso, a quantidade de corante incorporado é proporcional à quantidade de DNA, permitindo assim uma estimativa do número de células viáveis em cultura. Neste estudo este método foi utilizado para determinar a proliferação celular após o tratamento com os polissacarídeos e seus complexos com vanádio. Os resultados destes ensaios estão apresentados na figura 23. Assim como observado nos ensaios de viabilidade pelo método do MTT, os efeitos na proliferação das células HepG2 foram mais pronunciados após 72 h de tratamento com os biopolímeros (FIGURA 23 C). Os resultados mostram que somente o complexo MSAGM:VO (250 µg/mL) promoveu redução de ~50% na proliferação celular (FIGURA 23 C). No tempo de tratamento de 24 h (FIGURA 23 A), SAGM na concentração de 50 µg/mL reduziu a proliferação em ~25%, enquanto que MSAGM:VO na maior concentração (250 µg/mL) reduziu a proliferação em 28%. Para o tempo de tratamento de 48 h (FIGURA 23 B) os biopolímeros que reduziram a proliferação, foram SAGM e MSAGM:VO (250 µg/mL), em 25% e 36%, respectivamente.

FIGURA 22 - EFEITO DAS PREPARAÇÕES DAS GALACTOMANANAS NA VIABILIDADE DAS

NOTA: As células HepG2 foram cultivadas com os biopolímeros nas concentrações indicadas nas figuras; por 24h (A), 48h (B) e 72h (C), respectivamente. Os valores estão representados como média e ± DP de quatro experimentos independentes realizados em triplicata. * p < 0,05, ** p < 0,001 e *** p < 0,0001 representam os valores significativamente diferentes em relação ao controle (células incubadas somente com o meio de cultura) e entre as concentrações.

A B

C

FIGURA 23 - EFEITO DAS PREPARAÇÕES DAS GALACTOMANANAS NA PROLIFERAÇÃO DAS

NOTA: As células HepG2 foram cultivadas com os biopolímeros nas concentrações indicadas nas figuras; por 24h (A), 48h (B) e 72h (C), respectivamente. Os valores estão representados como média e ± DP de quatro experimentos independentes realizados em triplicata. * p < 0,05, ** p < 0,001 e *** p < 0,0001 representam os valores significativamente diferentes em relação ao controle (células incubadas somente com o meio de cultura) e entre as concentrações.

A atividade citotóxica de galactomananas nativas e modificadas tem sido avaliada em diferentes linhagens celulares (GAMAL-ELDEEN et al., 2006; GAMAL-ELDEEN et al., 2007; NOLETO et al., 2009; JOSEPH et al., 2013). Neste aspecto, Joseph e colaboradores (2013) avaliaram os efeitos das galactomananas isoladas do fruto Punica granatum em diferentes linhagens de células tumorais, dentre estas as células HepG2. A galactomanana foi capaz de reduzir a viabilidade das células HepG2 em ~ 40% na concentração 200 µg/mL após

A B

C

72 h de incubação. Os resultados obtidos por esses autores não são semelhantes aos do presente estudo em relação à galactomanana na sua forma nativa (SAGM) (FIGURA 22C), pois SAGM mostrou-se mais citotóxica, uma vez que ~ 50% de perda da viabilidade foi alcançada com 50 µg/mL em 72 h.

Em outro estudo duas preparações de galactomananas, nativa (GALMAN-A) e sua forma hidrolisada (GALMAN-B) de sementes de M. scabrella foram complexadas com oxovanádio (GALMAN-A:VO²⁺/VO³⁺ e GALMAN-B:VO²⁺/VO³⁺) e os efeitos foram avaliados em células HeLa (NOLETO et al., 2009). Ambos os complexos inibiram a proliferação celular em 60% em uma concentração dez vezes menor do que os biopolímeros não complexados. Neste caso, as preparações GALMAN-A:VO²⁺/VO³⁺ e GALMAN-B:VO²⁺/VO³⁺ foram mais citotóxicas do que as preparações SAGM:VO e MSAGM:VO, uma vez que, as galactomananas de M. scabrella reduziram a viabilidade das células HeLa na concentração de 50 µg/mL em um tempo de tratamento de 48 h.

A citotoxicidade de polissacarídeos e seus complexos com oxovanádio também foi observada em células de melanoma murino (B16-F10), quando estas células foram incubadas com xiloglucanas isoladas de Copaifera langsdorffii e seu complexo com oxovanádio (FARIAS, 2012). A viabilidade celular foi reduzida após o tratamento com a xiloglucana nativa (XCG) em todos os tempos de tratamento (24, 48 e 72 h), chegando a 50 % de redução para todas as concentrações (25 – 300 µg/mL) e tempos avaliados. Já o seu complexo com oxovanádio (XGC:VO²⁺/VO³⁺) reduziu a viabilidade em ∼ 66 % na maior concentração avaliada (300µg/mL) em 72 h. Estes resultados mostraram que o complexo (XGC:VO²⁺/VO³⁺) foi 1,3 vezes mais potente que a forma não complexada (XGC), em relação a redução da viabilidade das células B16F10, sugerindo que a presença do metal pode ter sido responsável por intensificar o efeito citotóxico. Em macrófagos peritoneais de camundongos, XGC na concentração de 100 µg/mL reduziu a viabilidade em ~30% em 48 horas de incubação (DO ROSÁRIO et al., 2011). Os resultados dos estudos descritos permitem sugerir que o efeito citotóxico da xiloglucana de sementes de C. langsdorffii depende da estrutura do biopolímero (se complexado com o vanádio ou não) bem como do modelo celular avaliado.

Estudos indicam que a presença de metais de transição (cobre, ferro, manganês, zinco e dentre outros) em preparações ativas visando o efeito citotóxico em células tumorais pode intensificar o efeito antitumoral (FREZZA et al., 2010; LI et al., 2016). Neste aspecto, Liao et al (2015) isolaram e complexaram polissacarídeos contendo em sua estrutura manose, glucose e galactose do fungo Dictyophora indusiata com zinco (DP1-Zn) de forma a potencializar o

efeito do biopolímero. Os autores compararam os efeitos dos polissacarídeos não complexados (DP1) e complexados DP1-Zn em células MCF-7 (células de câncer de mama).

Quando as células foram incubadas somente com DP1(250 µg/mL) por 48 h não foi observada redução na viabilidade, por outro lado, quando as células foram tratadas com DP1-Zn na mesma concentração e tempo de tratamento foi observada uma redução na viabilidade em ~ 20 %. Ainda neste sentido, polissacarídeos contendo em sua estrutura xilose, manose, glucose e galactose isolados de fungos Prunella vulgaris (P1) e complexados com Zn (II) (P1-Zn) foram incubados com células HepG2 em diferentes concentrações. Enquanto que P1 exibiu baixa toxicidade nessas células, P1-Zn foi capaz de reduzir a viabilidade de maneira dose dependente (125 – 500 µg/mL) chegando a uma redução de ~90 % na maior concentração e tempo de tratamento (48 h).

Em conjunto, estes estudos indicam que a presença do metal é importante para os efeitos citotóxicos. No presente trabalho, os resultados mostram que o biopolímero parcialmente hidrolisado complexado com oxovanádio (MSAGM:VO) é mais citotóxico do que a sua forma não complexada (MSAGM). Em contraste, a forma nativa (SAGM) foi mais citotóxica do que o complexo SAGM:VO em relação a viabilidade celular, porém semelhante em relação a proliferação celular. No tempo de 72 h, SAGM (250 µg/mL) reduziu a proliferação celular em intensidade ~ 3 vezes menor que a viabilidade. Vale ressaltar que as diferenças em relação à viabilidade e proliferação celular podem ser decorrentes do efeito das preparações no metabolismo celular, uma vez que o método do MTT avalia o metabolismo pela atividade das desidrogenases mitocondriais e o cristal violeta quantifica o número de células aderidas. Pode-se sugerir que no momento da interupção do tratamento das células metabolicamente não ativas ainda estejam aderidas à placa de cultura, o que resultaria em maior efeito citotóxico detectado pelo método do MTT. Para investigar como as galactomananas estariam reduzindo a viabilidade e proliferação celulares, seus efeitos sobre alguns parâmetros do metabolismo das células HepG2 foram avaliados.

6.2.2 Efeitos em alguns parâmetros do metabolismo celular